NLRP3 炎性小體在抗新孢子蟲感染中的作用及調控機制

王安琪 孔琳/延邊大學農學院動物醫學系 133002

炎癥小體（inflammasome）存在于細胞內，是一種由很多蛋白質組成的復合物，分子量很大，約為700 KDa，是天然免疫系統的重要組成部分。目前的許多相關研究都表明，炎癥小體參與了宿主的防御反應，其中，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide binding oligomerzation domain like receptorprotein3，NLRP3）炎癥小體，參與多種抗寄生蟲感染的作用及調控機制，已成為多個生物學領域的研究熱點。

新孢子蟲是一種細胞內寄生蟲，牛、羊等一些中間宿主感染新孢子蟲后會引起孕畜流產，對養牛業的繁殖具有巨大的沖擊，同時也帶來了極大的經濟損失。為進一步探索NLRP3 介導的炎性小體反應，本研究利用NLRP3 基因缺失小鼠深入研究NLRP3 炎性小體在抗新孢子蟲感染中的作用，為繼續探索NLRP3 基因的作用及機制奠定基礎。

1 材料

1.1 細胞與蟲株新孢子蟲速殖子和Vero 均為本實驗室凍存。

1.2 實驗動物C57BL/6 雌性小鼠，C57BL/6 雌性NLRP3，ASC 及caspase-1/11 基因缺失小鼠，均為6～8 周齡，體重20+4g，購自于長春億斯實驗動物技術有限公司。飼養環境：將小鼠置于25℃，濕度50%，獨立通風的環境中喂養，定時定量給予鼠料并自由飲水。

1.3 試劑與藥品RPIM-1640 培養基、胎血清牛、DMEM培養基均購自吉林省盟創生物科技有限公司；0.22μm PVDF膜購自北京世紀奧科生物技術有限公司；小鼠IL-1β，IL-18，IFN-γ，ELISA 試劑盒購自Sigma 公司。

2 方法

2.1 新孢子蟲的培養和純化參考楊慧珍的方法，從-80℃冰箱取出裝有蟲體的凍存管，立即放入37℃的水浴中，快速晃動，待蟲體懸液完全融解后，移入已經長成單層的Vero 細胞的培養瓶中，通過顯微鏡，觀察細胞和蟲體的生長狀態，間隔12h 換液一次，根據細胞狀態和蟲體數量確定傳代時間。傳代培養20d 后，獲得足量的、生長狀態良好的蟲體備用。

2.2 分離Vero 細胞中的新孢子蟲蟲體參考玄學南的方法，在蟲體生長達到旺盛時，倒掉舊的培養液，對細胞進行潤洗后，用細胞刮刮下細胞，通過5.0μm 孔徑的微孔濾膜，濾液收于50mL 離心管，將濾過的蟲體懸液2000rpm 離心10min，棄去上清液，加入50mL 不含血清培養液仔細重懸蟲體，在顯微鏡下，用細胞計數板計數蟲體個數，保存備用。

2.3 蟲體感染小鼠模型的建立用500μl PBS 重懸2×107新孢子蟲速殖子，然后進行小鼠的腹腔接種，感染10d 后，對組織進行采樣檢測；用500μl PBS 重懸1×107新孢子蟲速殖子，感染15d 后，對組織進行采樣檢測。

2.4 蟲量檢測將小鼠處死之后，用1mL 冷PBS 反復充分的沖洗小鼠腹腔，將腹腔內的灌洗液全部吸出，離心后，-20℃保存待用；分別取小鼠的心、肺和腦組織，加入液氮充分研磨，取100～200mg，用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，進行濃度測定后，-20℃保存待用；最后用絕對熒光定量PCR 檢測細胞組織中新孢子蟲的數量。

2.5 ELISA 檢測感染后的小鼠眼球采血，4℃靜置12h，將析出的血清8000g 離心10min，收集上清液，-20℃保存待用；將獲得的小鼠腹腔灌洗液離心取上清液，-20℃保存待用。稀釋樣品，用ELISA 試劑盒進行檢測。

2.6 數據處理用 Graphpad 軟件作圖，Student’s t 檢驗用于統計學分析。

3 結果

3.1 宿主被新孢子蟲感染后NLR P3 炎癥小體的保護作用為進一步了解新孢子蟲感染誘導的NLRP3 炎癥小體反應對宿主產生致病作用還是保護作用，將采用2×107新孢子蟲速殖子對小鼠進行持續30d 的腹腔感染。結果發現在感染第10d 時，對IL-1β 的分泌量進行檢測，WT 及三種基因缺失小鼠的血清中均未見IL-1β（圖1A），但發現WT 小鼠血清中有較高水平的IL-18，而在ASC-/-，Caspase-1/11-/-小鼠中IL-18 的含量顯著減少，NLIP3-/-小鼠中IL-18 的分泌也存在降低趨勢，但無明顯差異（圖1B）。對小鼠的腦組織、心臟、肺組織的新孢子蟲數量進行檢測發現，WT小鼠與NLIP 3-/-小鼠的蟲數無明顯差異，ASC-/-小鼠Caspase-1/11-/-小鼠腦組織中的數量與WT 小鼠相比明顯增多（圖1C）；ASC-/-小鼠和Caspase-1/11-/-小鼠心臟和肺組織中的數量遠遠大于WT 小鼠，但ASC-/-小鼠和Caspase-1/11-/-的數量沒有明顯差異（圖1D，E）。

圖1 NLRP3，ASC 和 caspase-1/11 在新孢子蟲感染中的作用

3.2 在新孢子蟲早期感染中NLR P3 炎癥小體介導細胞因子分泌宿主在感染新孢子蟲之后，NLRP3，ASC 和Caspase-1/11 可以誘導分泌IL-18，需要繼續探討這三種分子是否對其它細胞因子的分泌造成影響。采取1×107新孢子蟲速殖子對小鼠進行持續15d 的腹腔感染，再利用ELISA 方法檢測血清中的IL-1β，IL-18，IFN-γ 和TNF-α，結果發現新孢子蟲的感染無法介導NLIP3-/-，ASC-/-，Caspase-1/11-/-小鼠及WT 小鼠分泌IL-1β（圖2A）；新孢子蟲感染可以介導WT 小鼠分泌較高的IL-18，但其它三種基因缺失小鼠分泌的IL-18 數量顯著降低（圖2B）。并且三種基因缺失小鼠分泌IFN-γ 的數量也較WT 小鼠明顯降低（圖2C）。四種小鼠所分泌的TNF-α 數量無顯著差異（圖2D）。

4 討論

NLRP3 炎癥小體需要雙重信號的激活，第一種信號是由NF-KB 信號通路激活的，激活后，pro-IL-1β 和 pro-IL-18表達上調；第二種信號是由各種 DAMPs 或 PAMPs 激活的，與此同時，可以介導 IL-1β/IL-18 成熟分泌和細胞焦亡。為了進一步探討小鼠感染新孢子蟲后，NLRP3 炎癥小體在機體中的作用，本研究利用NLRP3，ASC 及caspase-1/11 缺失小鼠開展了一系列的試驗。

圖3.2 NLRP3，ASC 和 caspase-1/11在誘導促炎細胞因子中的作用

NLRP3，ASC 及caspase-1/11 在對宿主的保護過程及抵抗新孢子蟲的傳播中發揮著各自的作用。其中，NLRP3和ASC 主要的作用是控制宿主對新孢子蟲的易感性，而caspase-11 則會影響caspase-1 對新孢子蟲感染的易感性。缺失NLRP3，Asc 和 caspase-1/11 的小鼠感染新孢子蟲后，IL-1β 的成熟分泌及caspase-1 活化明顯減少甚至消失，說明新孢子蟲激活的炎癥小體反應依賴NLRP3，Asc 和 caspase-1/11。

機體感染新孢子蟲之后，可以激發機體的Th1 免疫應答，可以介導IFN-γ 和IL-12 的大量分泌，而且這些細胞因子在清除新孢子蟲和抗新孢子蟲的過程中發揮非常重要的作用。將IFN-γ 缺失的小鼠感染新孢子蟲后，小鼠不能使T 細胞分化，且NO 分泌減少，同時小鼠的存活率顯著下降。在本研究中，NLRP3，Asc 和 caspase-1/11 缺失小鼠感染新孢子蟲后，測量血清中的IFN-γ，結果顯示，IFN-γ 分泌明顯減少，推測這或許和炎癥小體介導分泌的IL-18 有關。

5 結論

通過以上的數據結果可以發現，由新孢子蟲感染所分泌的IL-18 部分依賴NLRP3，主要依賴ASC 和Caspase-1/11；在清除新孢子蟲與保護宿主時，這三種分子發揮不同的作用；NLRP3，ASC，Caspase-1/11 在新孢子蟲早期感染中介導IFN-γ 的分泌，對宿主抗新孢子蟲的Th1 應答有促進作用。