傳統醬油發酵制曲菌種中的酶活分析及制曲工藝優化

吳教培

（廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山 528415）

1 制曲菌種的主要類型及特點分析

1.1 米曲霉

米曲霉（見圖1）生長速度快，菌落在不同階段的色澤表現不同，初期以白色、黃色為主，成熟后呈現出黃綠色和淡綠褐色。溫度對米曲霉生長狀況的影響較為顯著，最佳溫度為30℃，低于28℃時菌體雖然增長但趨于緩慢，超過37℃時菌體代謝活動受到抑制，與此同時酶活也隨之降低。酸堿條件方面，pH 為6.0 時適宜米曲霉的生長。米曲霉屬于好氧微生物，因此通入足量氧氣是促進其生長的關鍵。在醬油釀造中，為保證食品的品質，需選擇優質的米曲霉菌種，其應當具備如下特點：①以蛋白酶為代表的酶系酶活高，此條件下可促進原料的分解。②代謝產物“無害化”，即不存在黃曲霉素或是其他的有害物質。③原料生長效率高。④基于米曲霉釀造的醬油有足夠的豉香味，整體品質穩定。

圖1 米曲霉實物（圖片來源：網絡）

在米曲霉菌株中，編號為滬釀3.042 的菌株主要特點是因為其生長速度快、酶蛋白活性高、適用范圍廣等，但也有局限之處——它的淀粉酶和酸性蛋白酶活力有限，發酵時的相應的酶解能力偏弱，導致產品的品質略微受到影響，例如醬油的風味較為單薄。針對該菌株的應用局限性，有關技術人員在原有基礎上加以誘變和改良，得到更具可行性的菌株。較之原菌株，經過紫外誘變的手段得到的突變菌的遺傳穩定性更可靠。

產蛋白性能提升；而通過紫外線和LiCl 復合誘變技術的應用，蛋白酶活力顯著增強，在醬油釀造中的優勢隨之凸顯，氨基酸態氮和全氮的含量均有提高。

1.2 黑曲霉

黑曲霉的主要適宜生長條件為：溫度37℃，pH5.6～6.0。得益于產糖化酶、淀粉酶能力較強的優勢，醬油制造中常常用黑曲霉，在發酵時摻入適量后，可以分泌豐富的酸性蛋白酶，在該產物的促進作用下，蛋白質利用率得以提高，且該變化在發酵中后期體現得更為明顯，隨之帶來氨基酸液態生成率提升的變化。依托于糖化酶、淀粉酶的共同作用，美拉得反應效率高，產生的基底物質在改善醬油品質方面效果良好，具體有：①促進增香酵母的生長，使醬油具有更濃郁的香氣。②加快風味物質的產生。不僅于此，黑曲霉分泌的其酶也依然具有利用價值，在改善醬油的風味方面有積極作用。

1.3 紅曲霉

溫度最高35℃最低32℃，pH 在4.5 左右的環境條件適宜紅曲霉生長，并且它對于發酵底物的選擇很寬泛，能夠有效地應用多種形式的氮源和碳源。紅曲霉對環境的抵抗性較好，在酸性、高溫環境中可維持相對穩定的狀態，糖化增香曲是紅曲霉的重要產物。此外紅曲霉的酯化和糖化能力都很強，而糖化增香曲更是為釀造提供了優質的原材料。通過糖化增香曲的應用，醬油中氨基酸態氮和總氮的含量均有增加的變化，醬油的綜合品質得到提升，具體體現在色澤、香味、口感等多個方面，釀造出的醬油更加受到消費者的青睞。

1.4 醬油曲霉

醬油曲霉與米曲霉相似，兩者的區別主要體現在酶的種類和活力兩個層面。在對堿性蛋白酶為參數標準進行對比中，醬油曲霉的活力更強，并且其與大豆蛋白接觸后將高效促進蛋白水解進程。雖然醬油曲霉在釀造領域具有優勢，但應用范圍相對較窄，主要在日本醬油釀造中取得應用，而絕大部分的醬油釀造普遍采用的是米曲霉等菌種。

2 試驗菌種與方法

2.1 菌種的選擇

將曲霉菌中進行編號，得出表1。

表1 醬油制曲中需要用到的菌種

為制備曲霉菌斜面，2%瓊脂，5B1 麥芽汁斜面共同作為培養基，在該原始裝置的基礎上接種一環原種，隨后予以7～10d 的培養。

2.2 醬油種曲的制備方法

按照豆粕:麥麩:水=20:80:110 的比例選用適量的原材料，構成混合物，向500mL 三角瓶中加入15g（要求選用的混合物有足夠的均勻性），予以40min 的滅菌處理，全過程中溫度均保持在121℃。按前述方法操作后，待其達到冷卻狀態時，接種兩環霉菌斜面孢子，再轉至30℃的恒溫環境中，持續72h 的培養。

2.3 菌種酶活力的表達

分多種情況考慮：以微克計算數據代表的酶活性單位u 的酶類型有：中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶；毫克計算數據表示的有糖化酶、谷氨酰胺酶；而以毫升計算數據來表示的只有淀粉酶。

3 試驗結果分析

（1）多項參數均在醬油呈固態發酵時發生變化，主要有物料、微生物群種、水量、溫度和pH。在發酵時，前期有溫度波動的情況，受溫度的影響，霉菌的細胞活動能力減弱，甚至幾乎達到停滯的狀態；醬油釀造的關鍵是綜合酶系，其主要源自于兩種途徑：①由種曲帶來。②在前期菌種生長期間產生。各類酶的最適pH 存在差異，在pH 降低的變化條件下，蛋白酶的酸堿環境發生改變，先從堿性轉至中性，再進一步轉至酸性，繼而進入到適應于該蛋白酶的最佳區間，其中表現較為顯著的為酸性蛋白酶，該部分可大幅度提高蛋白酶的利用率。從總蛋白酶活力的角度來看，黃曲霉2246 和米曲霉2339 在此方面的特性均較為突出，即總蛋白酶具有較強的活力。

（2）淀粉酶在醬油釀造中扮演著“轉化者”的角色，在與原料接觸后可對其中的淀粉加以分解，得到單糖，該類物質可被微生物利用，此時產生2 個方面的促進作用：①酵母和乳酸菌的生長更為旺盛。②醬油的還原糖含量增加，會產生醬油香味物質的前體。不同曲霉菌種的糖化酶活力存在差異，其中米曲霉2174 最高；從淀粉酶活力的角度來看，則以米曲霉2119 最為突出，可以說明的是，此類曲霉菌種的淀粉液化能力優于試驗中的其他菌種。

（3）谷氨酸是決定醬油鮮味程度的關鍵物質，但需注意的是，對于醬油植物原料而言有明顯的特殊性，并非所有的谷氨酸均以呈味的谷氨酰胺形式存在，因此谷氨酸的提鮮功能受到抑制。從這一角度來看，若要改善醬油的風味，需要將谷氨酰胺酶活力的提升作為重點的突破口，選擇的曲種在此方面應具有突出的能力。在本次分析的曲霉菌種中，各自的谷氨酰胺酶活力有所差異，其中以黃曲霉2062 和2246 兩類最為突出。

4 討論

（1）酸性蛋白酶與中性蛋白酶無明顯的關聯，就酶活力而言，酸性蛋白酶相對較弱，究其原因，可能與制曲條件偏中性有關，此環境下會對酶的表達產生抑制作用。高酸性蛋白酶活力醬油制曲菌種的選擇和培育將是未來研究的關鍵，得到釀造性能更為優越的優質菌種，將其作為醬油釀造時的原料，以保證醬油產品在色澤、口感等方面均更具優勢。

（2）研究內容的發展離不開對于酶活力的探討和工藝的進一步提升，取沒有拮抗的米曲霉2174 和2339，予以混合，產生的種曲的各類酶活力無明顯的“短板”，可以達到相對均衡的狀態；再將其投入至低鹽固態發酵試驗中，實際應用效果良好，釀造醬油的品質較高。