水鉀耦合對苜蓿根頸抗氧化特性及越冬率的影響

孫明雪， 張玉霞*， 叢百明， 夏全超， 田永雷， 張慶昕， 張冬梅

(1.內蒙古民族大學農學院/內蒙古自治區飼用作物工程技術研究中心，內蒙古 通遼 028041； 2. 內蒙古自治區通遼市畜牧獸醫科學研究所， 內蒙古 通遼 028000； 3. 內蒙古自治區農牧業科學院， 內蒙古 呼和浩特 010010)

隨著國民生活水平的提高，我國畜牧業得到快速發展，對飼草品質和數量的要求越來越高。苜蓿(Medicagosativa)是全世界廣泛種植的豆科飼用作物，是富含礦物質、蛋白質、維生素等的優質牧草[1]，其栽培管理技術十分重要。科爾沁地區屬于溫帶大陸性季風氣候，降雨主要集中在夏季，而我國北方地區的水資源嚴重短缺，農業灌溉水的利用率僅達到39%～50%[2-3]。水分在植物整個生命過程中發揮至關重要的作用，主要包括參與植物體內各種酶的生理生化反應、有機物的代謝等[4]。當植物受到干旱脅迫時，細胞的正常生命活動受阻導致活性氧大量積累，進而會引起抗氧化酶活性的變化，當超過植物的耐受范圍后，會造成植物死亡[5-6]。鉀是植物生命活動中不可缺少的大量元素之一，不僅高速透過生物膜，還與酶促反應密切相關，其中抗氧化清除系統中酶活性的啟動就需要鉀元素的參與[7-8]；也有研究表明鉀肥有利于降低丙二醛含量[9]，促進含氮化合物向蛋白質合成場所運輸[10]。水肥耦合是指將施肥和灌水融為一體以達到作物高品質高產的農業技術[11]，水分和鉀肥都對植物生長有重要作用，兩者之間即有相互協同[12]，又有相互拮抗的作用，一方面水分可以加速肥料的溶解，但水分過多時又會降低養分的濃度；而適度的鉀肥可以減少水分蒸騰。目前，關于水肥耦合對其他作物生理特性方面的研究有很多，但關于水鉀耦合對苜蓿抗寒生理特性影響方面的研究甚少，如何調節科爾沁沙地苜蓿越冬栽培管理中的水分和鉀素，提高苜蓿抗寒特性，因此，本研究分析了不同水鉀耦合處理下苜蓿根頸的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，過氧化氫酶(Catalase，CAT)，過氧化物酶(Peroxidase，POD)，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，可溶性蛋白(Soluble protein，SP)及越冬率(Winter survival rate，WSR)，以期為科爾沁沙地苜蓿生產中施鉀和水分管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于內蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗巖峰農業公司(北緯43°21′，東經119°2′)，屬于溫帶大陸性氣候，四季分明，降水集中。年平均氣溫3℃，10℃以上積溫3 000℃，無霜期150 d，年平均降水量400 mm，蒸發量是降水量的4～5倍左右，年平均風速3.7 m·s-1。土壤有機質含量為63.4 mg·kg-1，堿解氮含量34.89 mg·kg-1，全氮含量36.02 mg·kg-1，速效磷含量3.71 mg·kg-1，速效鉀含量77.98 mg·kg-1。

1.2 試驗方法

供試材料為苜蓿的‘騎士T’和‘公農1號’2個品種，由北京正道有限公司提供，于2017年7月1日進行播種。播種前一次性施入過磷酸鈣200 kg·hm-2為基肥。試驗設置土壤水分和施鉀量2個試驗因子，采用兩因素裂區隨機區組設計，水分處理為主區：灌水時間間隔分別為4 d(W1)，8 d(W2)和12 d(W3)，每次灌溉到距離土壤表面30 cm處，灌水量為15 mm；鉀肥施用量水平為副區：50 kg·hm-2K2O(K1)，100 kg·hm-2K2O(K2)和150 kg·hm-2K2O(K3)，并設置不施鉀肥為對照(CK)，兩個因素共組合成12個處理，每個處理3次重復。共36個小區。三個主區間隔15 m，副區各小區試驗面積4 m×5 m=20 m2，各小區間隔為2 m。播種量為22.5 kg·hm-2，供試肥料為氯化鉀(K2O≥60%)，灌水方式為指針式噴灌，期間進行正常的田間管理。于11月15日前后(越冬前期)挖取苜蓿越冬器官，帶回室內洗凈，切取根頸部分測定相關生理指標。

1.3 測定指標及方法

MDA含量采用硫代巴比妥酸法[13]，POD活性采用愈創木酚法[13]，SOD活性采用氮藍四唑法[13]，CAT活性采用紫外吸收法[13]，SP含量采用考馬斯亮藍比色法測定[13]。

越冬率：于播種當年2017年10月 26 日，每小區隨機設1平方米樣方3個，統計越冬前苜蓿植株數。2018年3月26日苜蓿出苗至2018年4月1日苜蓿返青全部出苗后(5 d內無新增出苗)，挖出后統計樣方內返青植株數，計算越冬率。越冬率=返青植株數/越冬前苜蓿植株數×100%[14]。

1.4 統計分析方法

試驗數據用Excel軟件處理、制作表格，用DPS7.0軟件進行方差顯著性分析及相關性分析，采用Duncan檢驗方法新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 水鉀耦合對苜蓿根頸MDA含量的影響

如表1所示，水分和鉀肥耦合對苜蓿根頸MDA含量具有顯著的影響，在不同灌水時間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸MDA含量均隨著鉀肥施用量的增加而下降，且在K2和K3施用量處理下的苜蓿根頸MDA含量顯著小于CK(W2處理除外，P<0.05)，并在K3鉀肥施用量處理下達到最小值，其中‘騎士T’品種苜蓿根頸的MDA含量較CK處理降低了45.74%和24.49%，而‘公農1號’品種苜蓿根頸的MDA含量較CK處理降低了32.26%和33.96%，說明施用鉀肥有利于降低苜蓿根頸的MDA含量。在不同鉀肥用量處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸MDA含量均在W2灌水時間間隔處理下達到最小值，在W3灌水時間間隔處理下達到最大值，且W3灌水時間間隔處理下的MDA含量顯著高于W2處理(P<0.05)，其中‘騎士T’品種苜蓿的MDA含量較W2處理增長了617.31%，566.67%和564.44%，‘公農1號’品種苜蓿的MDA含量較W2處理增長了332.56%，300.00%和268.42%，說明W2灌水時間間隔處理的水分最有利于減緩苜蓿根頸細胞膜質氧化過程，降低細胞膜受損程度。

表1 水鉀耦合對不同品種苜蓿根頸MDA含量的影響

2.2 水鉀耦合對苜蓿根頸CAT活性的影響

如表2所示，水分和鉀肥耦合對苜蓿根頸的CAT酶活性具有顯著的影響，在不同灌水時間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸CAT活性均隨著鉀肥施用量的增加而提高，在K2和K3鉀肥施用量處理下的CAT活性均顯著高于CK(W3處理的K2鉀肥施用量處理除外，P<0.05)，說明施用鉀肥有利于提高苜蓿根頸中的CAT活性，其中以施用量為100 kg·hm-2K2O和150 kg·hm-2K2O時，效果更好。在不同鉀肥用量處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸CAT活性均隨著灌水時間間隔的延長而增加(‘公農1號’的K3處理除外)，且在W3灌水時間間隔處理下達到最大值，說明W3灌水時間間隔處理的水分最有利于CAT活性的增強，清除H2O2，保護細胞膜結構。

表2 水鉀耦合對不同品種苜蓿根頸CAT活性的影響

2.3 水鉀耦合對苜蓿根頸POD活性的影響

如表3所示，在不同灌水時間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸POD活性均隨著鉀肥施用量的增加而提高，其中K2和K3鉀肥施用量處理下的POD活性均顯著高于CK(P<0.05)，說明施用鉀肥有利于提高苜蓿根頸中的POD活性,且以100 kg·hm-2K2O和150 kg·hm-2K2O為宜。在不同鉀肥用量處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸POD活性均隨著灌水時間間隔的延長而增加，在W3灌水時間間隔處理下達到最大值，且與W1灌水時間間隔處理的POD活性差異最顯著(P<0.05)，其中‘騎士T’品種苜蓿的POD活性較W1處理提高了55.03%，41.67%和40.14%，‘公農1號’品種的POD活性較W1處理提高了65.89%，73.03%和30.58%，說明W3灌水時間間隔處理的水分最有利于提高POD活性，清除活性氧，降低細胞膜受損程度。

表3 水鉀耦合對不同品種苜蓿根頸POD活性的影響

2.4 水鉀耦合對苜蓿根頸SOD活性的影響

如表4所示，在不同灌水時間間隔處理下，不同鉀肥用量處理的‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸SOD活性均高于CK，且均在K2鉀肥施用量處理下達到最大值并顯著高于CK(P<0.05)，其中‘騎士T’品種的苜蓿根頸SOD較CK增加了18.51%，18.65%和19.77%，‘公農1號’品種的苜蓿根頸SOD活性較CK增長了36.76%，21.19%，11.64%，說明施用適量的鉀肥有利于提高苜蓿根頸中的SOD活性。在不同鉀肥用量處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸SOD活性在W3灌水時間間隔處理下達到最大值，且與W1灌水時間間隔處理的SOD活性差異最顯著(P<0.05)，其中‘騎士T’品種的苜蓿根頸SOD活性較W1處理提高了10.67%，12.70%和9.41%，‘公農1號’品種的苜蓿根頸SOD活性較W1處理增長了13.21%，9.12%和5.33%，說明W3灌水時間間隔處理的水分最有利于提高SOD活性，清除更多活性氧和自由基。

表4 水鉀耦合對不同品種苜蓿根頸SOD活性的影響

2.5 水鉀耦合對苜蓿根頸SP含量的影響

如表5所示，在不同灌水時間間隔處理下，不同鉀肥用量處理的‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸SP含量均高于CK，且在K2鉀肥施用量處理下達到最大值，且均顯著高于CK(P<0.05)，其中‘騎士T’品種的苜蓿根頸SP含量較CK處理增加了13.42%，11.05%和11.36%，‘公農1號’品種的苜蓿根頸SP含量較CK處理增長了17.49%，14.83%和11.46%，說明施用適量的鉀肥有利于提高苜蓿根頸中的SP含量。在不同鉀肥用量處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿根頸SP含量在W3灌水時間間隔處理下達到最大值(‘公農1號’的K1處理除外)，且與W1灌水時間間隔處理的SP含量差異最顯著(P<0.05)，其中‘騎士T’品種的苜蓿根頸SP含量較W1處理提高了17.74%，17.76%和14.59%，‘公農1號’品種的苜蓿根頸SP含量較W1處理提高了32.25%，18.67%和33.61%，說明適當的減少灌水量有利于苜蓿根頸的SP含量的積累，維持細胞內的滲透壓。

2.6 水鉀耦合對苜蓿WSR的影響

如表6所示，不同灌水時間間隔處理下，不同鉀肥用量處理的‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿的WSR均高于CK，且在K2鉀肥施用量處理下達到最大值，且均顯著高于CK(P<0.05)，其中‘騎士T’品種的苜蓿的WSR比CK增加了52.95%，45.42%和31.39%，‘公農1號’品種的苜蓿的WSR比CK增加了37.23%，47.74%和36.96%，說明適量的鉀肥有利于促進苜蓿越冬。在不同鉀肥用量處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種的苜蓿WSR在W3灌水時間間隔處理下達到最大值，說明適當的延長灌水時間間隔有利于促進苜蓿越冬。

表6 水鉀耦合對不同品種苜蓿WSR的影響

2.7 根頸中MDA與抗氧化酶活性、SP含量及WSR的相關性分析

如表7所示，W1灌水時間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸CAT活性與POD活性均呈極顯著正相關(P<0.01)；‘公農1號’品種苜蓿根頸MDA含量與SOD活性呈顯著負相關(P<0.05)；‘公農1號’品種苜蓿根頸WSR與SOD活性及SP含量均呈顯著正相關(P<0.05)；‘騎士T’品種苜蓿MDA含量與POD活性呈顯著負相關(P<0.05)；‘騎士T’品種苜蓿SOD酶活性與CAT活性呈顯著正相關(P<0.05)，與SP含量及WSR呈極顯著正相關(P<0.01)；‘騎士T’品種苜蓿的WSR與CAT，POD活性均呈顯著正相關(P<0.05)，說明抗氧化酶活性的增強有利于提高苜蓿WSR，促進抗寒性增強。W2灌水時間間隔處理下，‘騎士T’品種苜蓿MDA含量與SOD，CAT活性呈極顯著負相關(P<0.01)；‘騎士T’品種苜蓿CAT活性與SOD活性呈極顯著正相關(P<0.01)，與SP含量和WSR呈顯著正相關(P<0.05)；‘騎士T’品種苜蓿根頸WSR與SOD活性呈顯著正相關(P<0.05)，與SP含量呈極顯著正相關(P<0.01)；‘公農1號’品種苜蓿根頸MDA含量與CAT活性呈顯著負相關(P<0.05),與POD活性呈極顯著負相關(P<0.01)；‘公農1號’品種苜蓿根頸CAT活性與POD活性呈顯著正相關(P<0.05)；‘公農1號’品種苜蓿根頸SOD活性與SP含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與WSR呈顯著正相關(P<0.05)。W3灌水時間間隔處理下，‘騎士T’品種苜蓿MDA含量與CAT活性呈顯著負相關(P<0.05)；‘騎士T’品種苜蓿根頸SOD活性與POD活性、SP含量均呈顯著正相關(P<0.05)；‘騎士T’品種苜蓿根頸SP含量與WSR呈顯著正相關(P<0.05)；‘公農1號’品種苜蓿根頸MDA含量與CAT、POD活性呈極顯著負相關(P<0.01)；‘公農1號’品種苜蓿根頸CAT活性與POD活性呈顯著正相關(P<0.05)；‘公農1號’品種苜蓿根頸SOD活性與WSR呈極顯著正相關(P<0.01)。以上說明苜蓿根頸中抗氧化酶、SP含量越高，MDA含量就越低，植物受傷害程度越輕，苜蓿越冬能力更強。

表7 苜蓿根頸MDA與抗氧化酶活性、SP含量及WSR的相關性分析

3 討論

當土壤中水分和肥力狀況不利于植物生長時，會對植物產生脅迫作用，使植物體內氧代謝失去動態平衡，活性氧大量積累，進而導致膜脂過氧化，積累很多過氧化產物如MDA等，因此，MDA含量可用作反應植物受傷害程度的指標[16]。本研究表明，‘騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸的MDA含量在灌水時間間隔為W1的處理時較高，在W2灌水時間間隔處理達到最小值，在W3灌水時間間隔處理時達到最大值，說明灌水時間間隔為8 d時最有利于減輕細胞氧化過程的傷害；張淋淋[17]的研究表明，土壤水分含量過少和過多均會對質膜造成損傷，并且脅迫強度越大損傷程度越嚴重，與本研究結果一致；劉岱松[18]的研究表明二倍鉀濃度處理、以及添加氨基酸和鉀處理降低煙苗(NicotianatabacumL.)葉片MDA含量，而本研究結果表明隨著鉀肥施用量的增加，苜蓿根頸中MDA含量表現為下降的變化趨勢，并在K3鉀肥施用量下達到最小值，說明鉀肥施用量水平為150 kg·hm-2K2O最有利于降低活性氧在植物體內積累。

SP是植物體內非常重要的滲透調節物質，具有降低滲透勢增加細胞質濃度，保持膨壓，緩解脫水脅迫傷害的生理作用，以保持細胞正常的生理過程[26]。本研究結果表明，‘騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸SP含量隨著灌水時間間隔的延長而增多，在W3處理灌水時間間隔處理達到最大值；隨著鉀肥施用量的增加，‘騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸SP含量表現為先升高后降低的變化趨勢，并在100 kg·hm-2K2O施用量處理達到最大值；蘇志豪[27]的研究表明隨著土壤干旱程度的加劇，沙生檉柳(Tamarixtaklamakanensis)種群葉片內SP呈上升趨勢；董慶[28]的研究結果表明隨著鉀肥水平的升高，蕨麻(PotentillaanserinaL.)葉片中SP含量成先升后降的趨勢，在78 kg·hm-2K2O到達最大值，與本研究結果一致。可能是由于鉀元素參與者植物體內蛋白質的代謝過程，適量的鉀肥促進了游離氨基酸等物質轉化為SP，并且鉀還能活化與蛋白質合成有關的酶，即有利于提高苜蓿根頸中SP含量[29-30]，SP含量增多，有利于調節滲透勢，維持細胞滲透壓和膨壓，保護生物膜的穩定性，維持細胞正常代謝。本研究結果表明，苜蓿WSR在W3處理灌水時間間隔處理下達到最大值，且隨著鉀肥施用量的增加表現為先升高后降低的趨勢，且在K2施用量處理下達到最大值；說明適量的鉀肥及水分脅迫有利于促進苜蓿越冬；孫洪仁[31]的研究結果表明鉀作為抗逆元素，苜蓿根部富含鉀素可有效提高作物抗寒性，利于苜蓿安全越冬，與本研究結果一致。并且本研究結果表明，苜蓿WSR與抗氧化酶活性呈顯著正相關，可能的原因是，抗氧化酶活性的增強能通過清除細胞內的活性氧和自由基，減少細胞內有毒害作用的物質對細胞膜的損傷，保護細胞膜結構，進而增強苜蓿的抗寒能力，促進苜蓿安全越冬[1]，其機理還有待進一步研究。

4 結論

綜上所述，‘騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸丙二醛含量K2和K3鉀肥施用量處理下顯著小于CK(W2處理除外，P<0.05)；騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸過氧化氫酶、過氧化物酶活性在W3灌水時間間隔處理下最強，且在K2和K3鉀肥施用量處理下與CK差異最顯著(P<0.05)；‘騎士T’和‘公農1號’品種苜蓿根頸在W3灌水時間間隔處理和K2鉀肥施用量處理下超氧化物歧化酶活性最強，可溶性蛋白含量和越冬率均最高。因此建議在科爾沁沙地進行苜蓿栽培，灌水時間間隔為12 d，鉀肥施用量為100 kg·hm-2K2O。