小麥WRKY轉錄因子的鑒定及其在胚性愈傷組織形成中的表達分析

楚宗麗，張睿男,2，李亮杰，孫君艷，王付娟，周 強，仝勝利

(1. 信陽農林學院，河南信陽 464006； 2.南京農業大學農學院，江蘇南京 210095)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國重要的糧食作物之一，高產優質小麥品種的選育對保證國家糧食安全和社會穩定具有重要意義。生物技術為作物新品種培育提供了有效途徑，但小麥組培效率較低，制約著生物技術在小麥育種中的應用。胚性愈傷組織容易再生獲得植株，是提高小麥組培效率的關鍵。胚性愈傷組織的形成是一個復雜的調控過程。植物胚性愈傷組織的形成受AGAMOUS-LIKE15(AGL15)[1-2]、 BABY BOOM[3-4]、LEC[5-6]等轉錄因子的影響，同時，逆境脅迫因子對植物胚性愈傷組織的形成也有影響[7-8]。

WRKY轉錄因子參與植物的多種生理代謝過程，是一類重要的轉錄因子家族，其N端含有高度保守的WRKY結構域，該結構域約由60個氨基酸殘基組成，包含高度保守的WRKYGQK序列，同時C末端含有一個鋅指結構，鋅指結構有C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H(C2H2)和C-X7-C-X23-H-X1-C(C2HC)兩種類型[9]。根據所含WRKY結構域的數目和鋅指結構類型，WRKY轉錄因子一般分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3組，其中，第Ⅰ組含有2個WRKY結構域和C2H2鋅指結構；第Ⅱ組含有1個WRKY結構域和C2H2鋅指結構；第Ⅲ組含有1個WRKY結構域和C2HC鋅指結構[10]。WRKY轉錄因子通過與(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)特異性結合，調節啟動子中含有該元件相關基因的表達。目前，在擬南芥[11]、水稻[12]、棉花[13]、豆類[14-15]、葡萄[16]、菠蘿[17]、月季[18]、茶樹[19]等多種植物中已經鑒定出WRKY轉錄因子。在小麥中，Niu等[20]利用小麥EST數據庫鑒定到43個TaWRKY基因，Okay等[21]和Gupta等[22]用逆境脅迫下的轉錄組數據也分別鑒定到160和107個TaWRKY基因。

WRKY轉錄因子參與植物的防御調控過程，包括響應多種生物和非生物脅迫[9,12,20-24]，如月季WRKY轉錄因子基因RcWRKY41在月季抗灰霉病中發揮作用[18]，棉花WRKY轉錄因子基因GhWRKY39-1在轉基因煙草中可提高對病原體的防御能力，并且可調節鹽脅迫耐受性[25]。小麥WRKY轉錄因子基因TaWRKY01和TaWRKY33可增強擬南芥抗旱和耐熱的能力[21]。同時，WRKY轉錄因子參與植物的衰老、萌發和休眠以及胚的形成等過程[26-28]。

然而，目前在全基因組范圍內進行小麥WRKY轉錄因子的鑒定及其在小麥胚性愈傷組織形成中的功能還未見報道。本課題組前期通過轉錄組測序分析了小麥胚性愈傷組織形成的分子機制，發現部分WRKY轉錄因子家族基因在胚性愈傷組織形成中上調表達[29]，但僅在所測序轉錄組數據范圍內進行了分析。小麥基因組序列的公布，為小麥WRKY轉錄因子家族成員的分析提供了基礎。本研究以小麥基因組數據為基礎，在全基因組范圍內進行了小麥WRKY轉錄因子的鑒定、分類、系統進化樹繪制、motif保守元件分析和基因結構分析，并對WRKY轉錄因子相關基因在小麥胚不同發育時期的胚性和非胚性愈傷組織中的表達模式進行分析，研究WRKY轉錄因子在小麥胚性愈傷組織形成中的作用，以期為研究小麥胚性愈傷組織形成的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 注釋基因組序列的獲取

從Ensembl Plants數據庫(http://plants.ensembl.org/)中獲取小麥基因組數據。同時，從PlantTFDB數據庫(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中下載水稻和擬南芥WRKY蛋白序列，用于多序列比對和系統進化樹的繪制。

1.2 小麥WRKY轉錄因子的鑒定

從Pfam網站((http://pfam.xfam.org/family/PF03106)下載WRKY結構域的隱馬爾科夫模型文件，Pfam編號為PF03106。使用Hummer Search 3.0軟件，在小麥基因組序列中通過隱馬爾科夫模型比對，搜索小麥WRKY轉錄因子，使用Perl程序，篩選Hummer搜索結果，篩選條件為E-value<1e-3[18]。為了確保已知基因組信息中所有小麥WRKY轉錄因子不被遺漏，從NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取擬南芥WRKY蛋白序列，通過Blast比對，搜索小麥注釋基因組序列中小麥WRKY轉錄因子。去除上述兩種操作結果中的重復序列，對余下的序列用SMART數據庫(http:// smart.embl.de/)和Pfam-CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進行蛋白結構預測，去除不含WRKY結構域的序列，保留確定的小麥WRKY轉錄因子序列。利用Perl程序對TaWRKY蛋白的分子量、等電點進行分析。使用MEGA 7.0軟件，參照擬南芥WRKY蛋白分類方法[24]對鑒定出的TaWRKY蛋白進行分類。

1.3 小麥WRKY家族系統進化樹的繪制

從PlantTFDB數據庫中分別挑選21個具有代表性的擬南芥和粳稻WRKY蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件，與TaWRKY蛋白進行多序列比對，繪制系統進化樹。算法為鄰接法(neighbor-joining，NJ)，模型為泊松模型，校驗參數bootstrap為1 000[24]。

1.4 小麥WRKY蛋白保守基序與基因結構分析

在Bio-Linux環境下，使用MEME 4.12.0軟件預測分析TaWRKY蛋白保守基序。具體參數為：搜索motif的總個數為10，motif長度范圍為6～50。使用Perl程序獲取TaWRKY基因在染色體上的外顯子、CDS、UTR位置，使用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對TaWRKY基因結構進行分析，并繪制基因結構圖。

1.5 小麥胚性愈傷組織中TaWRKY家族基因的差異表達分析

以小麥品種周麥18為材料，在其幼胚和成熟胚培養中，對來源于幼胚的胚性愈傷組織(培養3、6和15 d，分別用IME3、IME6和IME15表示)和成熟胚的非胚性愈傷組織(培養3、6和15d，分別用ME3、ME6和ME15表示)進行轉錄組測序，對轉錄組數據(ID：PRJNA353135，登錄號：SRP093588)[29]進行分析，獲得TaWRKY基因，并對不同轉錄組文庫中的TaWRKY基因進行差異表達分析。

1.6 差異表達基因實時定量PCR驗證

實時定量PCR反應在Bio-Rad CFX96TM實時定量系統上進行，PCR反應體系為25 μL，包括逆轉錄反應產物(cDNA溶液)2.0 μL、正、反向引物各1.0 μL(引物序列詳見表1)、2× SYBR Premix Ex TaqTMII 12.5 μL、RNase游離水8.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。以Actin基因(GenBank: AB181991)為內參，所有反應設置3個生物學重復，通過瓊脂糖凝膠電泳和溶解曲線分析驗證每對引物的特異性。以ME3文庫中的基因CT值作為參照，其表達水平設為1.0，使用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量[30]，結果以平均值±標準差表示。

表1 qRT-PCR所用引物

2 結果與分析

2.1 小麥WRKY轉錄因子的鑒定及分類

用Hmmer Search 3.0和NCBI Blast鑒定，分別獲得312和69個候選小麥WRKY轉錄因子，刪除兩者的重復部分，余下序列通過SMART數據庫和Pfam數據庫進行驗證，去除保守結構域或鋅指結構域不完整的序列，最后確定270個小麥WRKY轉錄因子(TaWRKY01～TaWRKY270)。根據WRKY保守結構域數目和鋅指結構域類型，將這些WRKY轉錄因子分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3組，其中，第Ⅰ組WRKY轉錄因子(TaWRKY01～TaWRKY41)均含有2個WRKY結構域和1個C2H2鋅指結構域，第Ⅱ組WRKY轉錄因子(TaWRKY42～TaWRKY186)均含有1個WRKY結構域和1個C2H2鋅指結構域，第Ⅲ組WRKY轉錄因子(TaWRKY187～TaWRKY270)均含有1個WRKY結構域和1個C2HC鋅指結構域，數量分別是41、145和84個。蛋白理化特性分析結果表明，TaWRKY蛋白氨基酸序列長度為135～1 482 aa，等電點為4.59～10.86，分子量為14 796.1～165 344.2。

2.2 WRKY轉錄因子家族的系統發育分析

從PlantTFDB數據庫中分別選擇21個具有代表性的完整的擬南芥和粳稻WRKY蛋白序列，與鑒定出的TaWRKY蛋白序列一起，利用MEGA 7.0進行多序列比對分析，繪制系統進化樹，結果如圖1所示。在I、II、III 3個分組中，TaWRKY蛋白主要分布在第II組中，根據基因結構和系統進化樹關系，可進一步分為3個亞組：II-a、II-b和 II-c(圖1)，在系統進化樹中，每個分組聚類為一個分支，組II中II-a、II-b和II-c分別聚類為一個分支，總計5個分支。

黑色、紫色和紅色分別表示小麥、水稻和擬南芥中的WRKY成員。

2.3 TaWRKY蛋白保守基序分析

在Bio-Linux環境下，用MEME 4.12.0軟件對TaWRKY蛋白序列進行保守基序掃描，共搜索到10個保守基序，命名為motif 1～motif 10(圖2A)，其中motif 1～ motif 5和motif 8均含有WRKY轉錄因子的WRKYGQK序列(如圖2B)，TaWRKY蛋白一般含有2～4個保守基序(除TaWRKY194、TaWRKY241、TaWRKY203和TaWRKY216僅含1個基序)(圖2A)，基序分布特征相似的TaWRKY在系統發育樹中關系較近。

圖2 TaWRKY蛋白的基序分析

A：TaWRKY蛋白的基序分布; B：TaWRKY蛋白的基序序列。氨基酸字母的高度代表在該位點相應氨基酸的相對頻率。

2.4 TaWRKY基因的結構分析

在Bio-Linux環境下，通過Perl程序進行分析，用CSDS 2.0軟件繪制基因結構圖，結果(圖3)表明，大部分TaWRKY基因包含1～5個內含子(除TaWRKY13包含8個內含子)。在同一進化分支的TaWRKY基因表現出類似的基因結構，如TaWRKY167和TaWRKY168。但也有一些例外，如TaWRKY39和TaWRKY40雖然聚類為同一分支，但TaWRKY40僅有1個內含子，而TaWRKY39含有3個內含子。

圖3 部分TaWRKY的基因結構

2.5 TaWRKY基因在小麥胚性愈傷組織形成過程中的表達模式

用周麥18幼胚培養3、5和15 d獲得的胚性愈傷組織(IME3、IME6、IME15)和成熟胚培養3、5和15 d獲得的非胚性愈傷組織(ME3、ME6、ME15)構建轉錄組測序文庫，對不同文庫的轉錄組數據進行分析。結果表明，共鑒定獲得39個TaWRKY基因(表2)，其中27個在基因組數據庫中鑒定到且在愈傷組織中表達，12個在小麥基因組數據中沒有鑒定到，僅在小麥愈傷組織發育中特異表達(配對比例為0)。TaWRKY基因在不同轉錄組文庫中的差異表達分析表明，共有11個TaWRKY基因差異表達，其中包含5個(TaWRKY275、TaWRKY276、TaWRKY277、TaWRKY280和TaWRKY281)特異表達，結果見表3。隨機選擇8個差異表達的TaWRKY基因(含3個特異表達)進行qRT-PCR驗證，結果與轉錄組測序結果一致(表4)。

表2 小麥胚性愈傷組織形成中鑒定到的TaWRKY基因

表3 小麥胚性愈傷組織形成中差異表達的TaWRKY基因

表4 隨機選取的8個TaWRKY差異表達基因在小麥愈傷組織中的相對表達量

3 討 論

WRKY轉錄因子在高等植物中廣泛存在，家族成員較多，參與調控植物的多種生物學功能。隨著植物基因組測序的逐漸完成，多種植物在全基因組范圍內已經進行了WRKY轉錄因子家族成員的鑒定[13-19]，而小麥WRKY轉錄因子的研究多以轉錄組或EST序列為基礎[20-22]，小麥基因組信息的公布為在全基因范圍內進行小麥WRKY轉錄因子的研究提供了條件。本研究利用小麥基因組數據庫，同時結合小麥胚性愈傷組織形成中的轉錄組數據，共鑒定獲得270個小麥WRKY轉錄因子，根據WRKY結構域特征可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組[10]，分別含有41、145和84個小麥WRKY轉錄因子，均多于擬南芥、水稻、棉花等植物中鑒定到的WRKY轉錄因子數量[11-12,31-32]，可能這與小麥是六倍體及其具有龐大的基因組有關。

在研究方法上，本研究用Hummer搜索和NCBI Blast兩種方法相結合來鑒定小麥WRKY轉錄因子，可能也是鑒定到小麥WRKY數量較多的原因之一。

在小麥胚性愈傷組織發育過程中，共鑒定到39個TaWRKY基因，其中12個在小麥愈傷組織發育過程中特異表達。在小麥胚性愈傷組織中鑒定到的小麥WRKY轉錄因子數量(39)遠小于小麥全基因組條件下鑒定到的小麥WRKY轉錄因子數量(270)，這可能與該數據是來源于特定發育時期的材料以及轉錄組測序的程度有關。

WRKY結構域中存在高度保守的WRKYGQK序列，但也存在變異，如在水稻中，WRKYGEK和WRKYGKK是WRKY轉錄因子中WRKY結構域兩個常見的變異[31,33]。本研究在小麥中也發現了WRKYGEK和WRKYGKK兩種變異，其中有13個小麥WRKY轉錄因子存在WRKYGEK變異(均位于第III組)，有15個存在WRKYGKK變異(有3個位于第I組，該組中有兩個WRKY結構域，一個變異，另一個不變異；有12個位于第II組)。

小麥胚性愈傷組織的形成是一個復雜的過程，本研究發現，在小麥胚性愈傷組織不同發育時期，有11個TaWRKY基因差異表達，其中5個特異表達，說明小麥WRKY轉錄因子與胚胎愈傷組織的形成相關，小麥WRKY轉錄因子通過何種途徑對植物胚胎愈傷組織的形成進行調控還需進一步研究。