利用Connectivity Map數據庫篩選抗菌藥物的初步研究

劉曼莉，舒 芬，張亞妮，方 偉，王開梅，吳兆圓

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

細菌性傳染病是威脅人類和動物健康的重要病原，自20世紀20年代抗生素的發(fā)現到現在，抗生素仍是解決細菌性傳染病的重要手段，然而耐藥性問題急需新型抗細菌感染的策略和藥物。

Connectivity map（Cmap）是Lamb等［1］利用1千多個小分子藥物處理人類細胞后獲得的超過7 000個全基因組表達譜的數據庫。研究人員利用Cmap研究新化合物的活性、推論藥物的主結構與藥理作用、找到疾病治療的新靶點。Gao等［2］發(fā)現celastrol和withaferin可作為化學伴侶和抗肥胖藥物；Dyle等［3］發(fā)現番茄堿可治療骨骼肌萎縮；Dudley等［4］發(fā)現托吡酯治療炎癥性腸病；Brum等［5］發(fā)現丁苯咪唑是治療骨關節(jié)炎的重要藥物等。Connectivity map是一個老藥新用、研究新化合物活性、篩選新靶點潛在的有廣泛應用前景的工具。

生物堿類化合物廣泛存在于動植物中，是一類含氮雜環(huán)的有機物，具有堿性和顯著的生理活性，是重要的天然產物之一。目前已鑒定的生物堿有超過2萬個，一些生物堿因其抗腫瘤、抗菌和抗病毒活性，及低毒性、低成本成為研究的熱點。

本研究通過Cmap數據庫篩選潛在抗菌活性化合物的過程中，篩選到石蒜堿（Lycorine）、左旋水蘇堿（Betonicine）、玫瑰樹堿（Ellipticine）3個生物堿類化合物具有潛在抗菌活性，并對它們的抑菌活性及抗溶血活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）ATCC 27853、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）ATCC 25923由湖北省生物農藥工程研究中心保存，豬丹毒桿菌（Ery?sipelothrix rhusiopathiae）WH13013、豬鏈球菌（Strep?tococcussuis）SC19由華中農業(yè)大學譚臣教授課題組提供。

1.2 試劑

大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基，由酵母粉、胰蛋白胨和氯化鈉按配方配制，固體培養(yǎng)基是在LB中加入瓊脂粉。酵母粉和胰蛋白胨購自OXOID公司，氯化鈉和瓊脂粉購自國藥集團化學試劑有限公司。

綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌使用含10%小牛血清的TSB和TSA培養(yǎng)基。TSB和TSA培養(yǎng)基購自BD Difco公司按配方配制，小牛血清購自杭州四季青生物有限公司。

石蒜堿（B21169，≥98%）和頭孢匹羅（Cefpirome sulfate，S25863，98%）購自上海源葉生物科技有限公司。左旋水蘇堿（ZES-0605，N/A）購自法國EXTRA?SYNTHESE公司。玫瑰樹堿（T4614，98.85%）、青霉素（Ampicillin，T0814L，99.27%）和鏈霉素（Strepto?mycin sulfate，0060，720IU）購自上海陶素生化科技有限公司。石蒜堿、左旋水蘇堿和玫瑰樹堿均使用DMSO溶解，青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅用無菌水溶解，化合物的儲存濃度均為10 mg/mL，試驗時使用細菌培養(yǎng)基LB或TSB稀釋成相應的使用濃度，同時設立DMSO和水的陰性對照孔。

綿羊紅細胞購自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Connectivity map數據庫分析 將豬鏈球菌感染THP-1細胞中的差異表達基因（accession num?ber：GSE20508）分別以UP和DOWN文件輸入Con?nectivity map數據庫，除去不能識別的數據，進行分析，獲得6 100個化合物的Connectivity score，從Con?nectivity score為負的數據中進行挑選。

1.3.2 藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用美國臨床和實驗室標準委員會（CLSI 2012）推薦的微量肉湯稀釋法進行。將純化的細菌劃線接種于LB或TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h。將菌液按1∶1 000的比例接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.5（菌量約為1×108CFU/mL），再將菌懸液1∶100稀釋后備用。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50μL倍比稀釋不同濃度的藥物，加入50μL稀釋的菌液，每種藥物每株菌3次重復，同時設陰性對照和陽性對照。對照藥物選擇青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅。置于37℃溫箱中孵育16～20 h，讀取測定結果。

肉眼觀察微量稀釋孔中以無細菌生長現象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對該種細菌的藥物最小抑菌濃度。平行操作3次，以3次結果的平均值作為此藥對該細菌的MIC。

1.3.3 藥物抗溶血試驗 細菌于相應的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜（37℃搖床220 r/min），1∶500擴大培養(yǎng)4 h至對數生長期，分裝成3 mL/細菌瓶，加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。取1 mL培養(yǎng)物離心（10 000 r/m，1 min）收集上清液，取150μL上清液于96孔板中，加入2%綿羊紅細胞150μL，同時分別做加入150μL的LB或TSB的陰性對照和加入150μL 1%Triton X-100的陽性對照，于37℃作用2 h，8 000 r/min離心10 min。將150μL上清液移到新的96孔板中，用分光光度計測定OD540nm。樣品的溶血百分比=［（樣品OD540nm-陰性對照OD540nm）/（陽性對照OD540nm-陰性對照OD540nm）］×100%。

2 結果與分析

2.1 Connectivity map數據庫分析及抗菌化合物挑選

將豬鏈球菌感染THP-1細胞結果中的差異表達基因按Connectivity map網站的要求，分別以UP和DOWN的文件輸入數據，通過分析，獲得化合物的相關Connectivity值，共有1 685個化合物Connec?tivity值為負值。篩選出石蒜堿、左旋水蘇堿和玫瑰樹堿等3個具有潛在抗菌活性的生物堿類化合物，相關結果見表1。

表1 3個化合物的Connectivity map分析結果

2.2 抗菌活性研究

將3個化合物與5株菌作用，研究化合物對G+和G-菌的抑菌情況，同時使用青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅作為陽性對照。由表2可知，玫瑰樹堿對4種菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌和豬鏈球菌均有抑菌效果，且MIC與鏈霉素效果相當或更優(yōu)。左旋水蘇堿和石蒜堿對5株菌均無明顯的抑菌效果。

表2 化合物的MIC結果

2.3 藥物抗細菌溶血活性

為了研究菌株的溶血活性，將5株菌分別培養(yǎng)6、12、24 h，離心取上清液與紅細胞在37℃共培養(yǎng)2 h，由表3可知，金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌有較強的溶血活性。

表3 5株菌的溶血活性

將3個化合物與金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌共作用12 h，取上清液與紅細胞進行溶血試驗。由圖1可以看出，玫瑰樹堿對2株菌均有明顯的抑制溶血活性。石蒜堿和左旋水蘇堿在64μg/mL對2株菌無明顯抑制溶血活性。

圖1 玫瑰樹堿抑制金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的溶血活性

3 討論

本研究利用豬鏈球菌感染的THP-1芯片信息，通過Cmap數據庫分析，獲得化合物的相關信息，從中挑選了石蒜堿、左旋水蘇堿、玫瑰樹堿3個生物堿類化合物進行抗菌活性研究。結果表明，石蒜堿和左旋水蘇堿對5株菌沒有明顯的抑菌活性。玫瑰樹堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌均有明顯的抑菌作用，但對綠膿桿菌沒有明顯的抑菌作用。而且玫瑰樹堿能抑制金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的溶血活性，說明玫瑰樹堿具有廣譜的抗菌、抗溶血活性。

玫瑰樹堿是一種吲哚并異喹啉類生物堿，主要是從夾竹桃科玫瑰樹屬植物古城玫瑰樹（Ochrosia elliptica）的葉中分離出的天然生物堿［6，7］，玫瑰樹堿及其類似物具有抗腫瘤、抗病毒［8-10］及抗菌活性。玫瑰樹堿對豬鏈球菌和大腸桿菌有較好的殺菌作用，并能很好地抑制豬鏈球菌的溶血活性，減輕豬鏈球菌導致的小鼠肺損傷［11，12］。有研究表明，玫瑰樹堿的衍生物對角叉菜膠致大鼠多發(fā)性關節(jié)炎具有保護作用［13］，也可以削弱脂多糖（LPS）誘導的急性肺炎［14］等。玫瑰樹堿的季銨鹽是D-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶抑制劑，是細菌細胞壁合成必需的胞內酶［15］。玫瑰樹堿的作用機制主要包括DNA嵌入、抑制拓撲異構酶Ⅱ、大分子共價烷基化和誘導內質網壓力等［16-20］。

生物堿是一類含氮雜環(huán)的有機物，已知的生物堿有上萬種，主要存在于植物中。生物堿類化合物有較強的生理活性，是中草藥中重要的有效成分之一。石蒜堿屬生物堿，具有抗菌、抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤等多方面的作用［21-26］。研究發(fā)現石蒜堿抗腫瘤機制可能是通過干擾DNA的模板功能，影響DNA轉錄過程，從而抑制RNA的合成［27，28］。而且石蒜堿能抑制P38和STATs的激活并降低LPS誘導的炎癥反應及小鼠死亡率［29］。左旋水蘇堿是益母草的主要活性成分之一，能拮抗LPS所致的病理損傷［30］。左旋水蘇堿的研究并不多，但有研究發(fā)現左旋水蘇堿能參與抑制細菌根瘤農桿菌（Agrobacterium tume?faciens）的群體效應［31，32］。

本研究中Cmap的篩選結果里包含了玫瑰樹堿、石蒜堿和左旋水蘇堿。玫瑰樹堿有較好的抗菌和抑制溶血的活性，但石蒜堿和左旋水蘇堿的直接殺菌和抑制溶血作用不明顯。因此，Cmap在藥物篩選過程中有重要的應用價值，但仍需要通過試驗進行驗證。