鹽酸林可霉素可溶性粉含量測定方法

董書香，王 峻，陳向丹，丁 陽

（湖北省獸藥監察所，武漢 430070）

林可霉素（lincomycin）是由鏈霉菌產生的一種林可胺類堿性抗生素，其作用機制與紅霉素非常相似，通過抑制微生物蛋白質的合成而產生作用［1］。對革蘭氏陽性球菌［2］，如葡萄球菌、溶血性鏈球菌和肺炎球菌作用較強，對厭氧菌如破傷風梭菌、產氣莢膜芽孢桿菌也有抑制作用［3］；對支原體螺旋體有效，對弓形體也有一定作用，獸藥臨床上廣泛用于敏感菌所致的畜禽細菌性疾病的治療，且效果顯著［4］。鹽酸林可霉素在治療各種感染中得到了廣泛應用，因此建立鹽酸林可霉素快速而有效的含量檢測方法尤為重要。目前，鹽酸林可霉素的含量測定方法有色譜法、質譜法、光譜法［5，6］。獸用鹽酸林可霉素可溶性粉，收錄于《獸藥質量標準》（2017年版）化學藥品卷［7］，其中采用高效液相色譜法對含量進行測定。該方法使用的流動相為0.05 mol/L硼砂溶液（用85%磷酸溶液調節pH至6.0）-甲醇（4∶6，V/V），在實際試驗過程中，發現該流動相中使用了高濃度硼砂鹽溶液，硼砂是含10個水分子的化合物，放置時間過長容易失水風化，導致配制的流動相中硼砂濃度超過標準濃度［8］，且高濃度鹽溶液對色譜柱和液相系統都有較大的損害，長期處于高濃度鹽溶液環境中，將大大縮短色譜柱和儀器的使用壽命［9］。研究一種新的液相色譜方法來改善以上問題，即可提高檢測效率，又可以延長儀器和耗材壽命。本研究優化了高效液相色譜流動相，探討了高效液相色譜法測定鹽酸林可霉素可溶性粉含量的方法，并對方法進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

林可霉素對照品（中國獸醫藥品監察所，含量：84.6%，批號：K0101503）；甲醇、乙腈（安徽天地高純溶劑有限公司）為色譜純；硼砂（國藥集團化學試劑有限公司）為分析純；磷酸氫二銨（國藥集團化學試劑有限公司）為分析純；水為二次純化水；鹽酸林可霉素原料，輔料，10%鹽酸林可霉素可溶性粉樣品（批號為201905311、202005081、202005201）均由武漢某獸藥公司提供。

1.2 儀器

島津20AD高效液相色譜儀配紫外檢測器；Met?tler AE240電子天平；MILIPORE超純水處理器等。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，4.6 mm×150 mm，粒徑5μm；流動相：0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.3.2 溶液的配制 精密稱取林可霉素對照品20 mg，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密稱取鹽酸林可霉素可溶性粉供試品0.2 g，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

1.3.3 線性試驗 精密稱取林可霉素對照品100 mg，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為4 mg/mL貯備液。分別精密量取貯備液適量，用流動相分別稀釋至濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、4.0 mg/mL的溶液，各取10μL進樣，記錄色譜峰面積，以濃度（C，mg/mL）為橫坐標，峰面積（mV）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 專屬性試驗 按“1.3.1”色譜條件，分別取供試品輔料空白溶液、對照品溶液以及供試品溶液注入液相色譜儀，考察專屬性。

1.3.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（林可霉素0.8 mg/mL）10μL，按“1.3.1”色譜條件，連續重復進樣6次，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差RSD，考察精密度。

1.3.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液（批號201905311）（林可霉素0.8 mg/mL），按“1.3.1”色譜條件，在不同時間（0、1、2、4、6、8、10、12、24 h）分別進樣10μL，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差RSD，考察穩定性。

1.3.7 重復性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號201905311）（林 可 霉 素0.8 mg/mL）10μL，按“1.3.1”色譜條件，連續重復進樣6次，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差RSD，考察重復性。

1.3.8 回收率試驗 配制10%的鹽酸林可霉素可溶性粉，分別精密稱取16、20和24 mg的林可霉素對照品及0.2 g的輔料置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，按“1.3.1”色譜條件進行測定，按外標法計算林可霉素的含量，計算回收率。

1.3.9 樣品的測定 分別取同一廠家不同批號的鹽酸林可霉素可溶性粉，按“1.3.1”色譜條件進行測定，每個樣品制備2份，計算樣品中林可霉素的含量，取平均值。同時與《獸藥質量標準》（2017年版）化學藥品卷的色譜條件比較。

2 結果與分析

2.1 線性試驗

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸（圖1），得回歸方程：y=2×106x+473 55，R2=0.999 7。可見在此色譜條件下林可霉素在0.1～4.0 mg/mL范圍內線性良好。

圖1 林可霉素的線性回歸

2.2 專屬性試驗

色譜圖中林可霉素峰與各雜質峰分離效果好，含量測定不受其他雜質峰的干擾，色譜圖見圖2、圖3、圖4。

圖2 林可霉素可溶性粉輔料空白溶液的HPLC圖

圖3 林可霉素對照品溶液（0.8 mg/mL）的HPLC圖

圖4 林可霉素可溶性粉供試品溶液（0.8 mg/mL）的HPLC圖

2.3 精密度試驗

連續進樣6次，測得林可霉素峰面積平均值為1 841 314，RSD為0.3%。該方法表明精密度良好。

2.4 穩定性試驗

在不同時間（0、1、2、4、6、8、10、12、24 h）分別進行測定，測得林可霉素峰面積平均值為1 886 971，RSD為0.4%，表明供試品溶液在室溫下24 h內性質穩定。

2.5 重復性試驗

連續進樣6次，測得林可霉素峰面積平均值為1 890 536，RSD為0.2%，表明該方法重復性良好。

2.6 回收率試驗

加樣回收率考察結果見表1。結果表明，林可霉素峰平均回收率為99.5%，RSD為1.2%，表明該法符合試驗分析要求，準確度高。

表1 鹽酸林可霉素可溶性粉的回收率試驗結果（n=9）

2.7 樣品的測定

分別取同一廠家不同批號的樣品，采用“1.3.1”色譜條件進行測定，試驗結果見表2。樣品測定結果中可以看出，該方法與其他兩個色譜條件測定的結果基本一致。

表2 樣品含量測定結果（標示量//%，n=2）

2.8 耐用性

比較了InertSustain C18（4.6 mm×150 mm）和Agi?lent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱。結果表明，兩者均可使林可霉素分離度，理論塔板數良好，選擇溫度為25℃和35℃時，除出峰時間發生變化外，其余變化很小；將流動相水相和有機相比例調整為（70∶30，V/V）和（80∶20，V/V）進行測試，表明流動相比例的微調也僅能影響出峰時間，對峰形和理論塔板數影響甚小。不同品牌的色譜柱、不同流動相、有機相與水相比例以及不同溫度，均能滿足試驗需要，該方法耐用性較好。

3 小結

在波長選擇上，由于林可霉素在200 nm有最大吸收，但該處容易受溶劑干擾［10］，因此本研究沿用《獸藥質量標準》（2017年版）化學藥品卷的214 nm作為檢測波長。該方法測定鹽酸林可霉素可溶性粉的含量，與《獸藥質量標準》（2017年版）化學藥品卷方法比較，結果基本一致。該方法使用了溶解性較好的磷酸氫二銨作為水相溶質，且配制流動相時不需要調節pH，縮短了時效，減少了鹽溶液對色譜系統的污染，提高了色譜系統的穩定性，同時操作簡便、快速，重現性好，專屬性強，結果準確可靠，可作為該制劑的含量測定方法的參考，特別是在獸藥企業內部質量控制方面也有一定的指導作用。