超高壓處理對低醇沙棘蜂蜜酒品質的影響

崔媛媛，張禎，李熠，李霽昕，陳永浩，張煜，把靈珍，蔣玉梅*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產業技術中心，甘肅 蘭州，730070)2(中國農業科學院農產品加工研究所，北京，100093)

蜂蜜酒是由蜂蜜加水稀釋、調整成分后經酵母發酵而成的一種酒精飲料[1]。由于蜂蜜香氣半衰期短，陳釀后蜂蜜酒香氣不足，感官品質不能滿足消費者需求，一般通過添加香料或果、蔬汁改善蜂蜜酒的色澤、香氣和口感[2]。沙棘果實含有豐富的維生素、類胡蘿卜素、礦物質、黃酮等營養活性物質，是一種藥食同源的食品加工原料[3]。沙棘原漿與油菜蜜按一定比例復配后進行發酵，既可改善蜂蜜酒香氣寡淡、酸度低、酒體弱的缺陷，又可解決沙棘原漿直接發酵時糖分不足、酸度高、口感酸澀的問題。

隨著消費者對飲料健康性關注度的增加，低醇發酵飲料的市場需求不斷擴大。低醇發酵飲料酒精含量低，陳釀和貯存過程容易滋長微生物，導致產品品質下降或酸敗。二氧化硫是果酒生產常用的抑菌、抗氧化劑，但易引發過敏，影響人體健康。超高壓(high hydrostatic pressure，HHP)作為一種食品非熱加工新技術，在常溫或低溫下利用100 MPa以上的壓力，通過水或其他介質傳遞高壓給樣品，改變微生物的細胞形態、細胞壁的生物聚合物和非共價鍵，抑制酶活性并殺滅細菌和其他微生物[4]，在食品抑菌、酒類催陳、活性物質提取等領域有較多的研究和應用。

研究以沙棘原漿和油菜蜜為原料，通過發酵、加硫或HHP處理制備低醇沙棘蜂蜜酒，以完成發酵樣品為對照，分析加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒理化、色澤和香氣品質的影響，探討HHP技術在低醇沙棘蜂蜜酒制備中的應用優勢，以期為蜂蜜酒新產品研發和產業發展提供科學數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 釀酒原料

沙棘原漿[還原糖含量(68.5±0.41) g/L，pH (2.84±0.01)]，甘肅隴源紅生物科技有限公司；油菜蜜[還原糖含量(751.00±41) g/L]，采自四川成都平原；酵母[商業釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Aroma White]，意大利Enartis公司。

1.1.2 儀器與設備

Thermo Scientific 265079 GC-MS，DB-WAX色譜柱(60 m×2.5 mm，0.25 μm)，美國Thermo Scientific公司；固相微萃取頭，DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)，美國Surpelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 低醇沙棘蜂蜜酒釀造工藝流程

低醇沙棘蜂蜜酒釀造工藝如下：

油菜蜜→加水稀釋→滅菌→復配沙棘原漿→添加酵母→發酵→澄清處理→加硫或HHP處理→裝瓶→低醇沙棘蜂蜜酒

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 發酵醪制備

油菜蜜加水稀釋，攪拌均勻，80 ℃水浴20 min滅菌，降至室溫，添加沙棘原漿[V(沙棘原漿)∶V(蜂蜜)∶V(水)=1∶2.8∶15.2]。可溶固形物含量(18.4±0.0)°Brix，pH值3.52±0.01，總酸含量(4.59±0.05)g/L(以酒石酸含量計)。

1.2.2.2 酵母的添加

釀酒酵母于(38±0.1)℃活化30 min，加入發酵醪，添加量為300 mg/L。

1.2.2.3 酒精發酵

(25±2)℃發酵，每24 h測定酒精度，酒精度達到6 %vol，終止發酵。

1.2.2.4 澄清處理

添加復合澄清劑1.2 g/L[V(2%殼聚糖溶液)∶V(2%明膠溶液)=2∶1]，40 ℃處理50 min，室溫靜置12 h，在4 000 r/min離心、過濾。制得對照樣和試驗酒樣。

1.2.2.5 抑菌處理

加硫處理：添加60 mg/L的SO2抑菌(以亞硫酸計)；4 ℃貯存1周后，分析檢測；

HHP處理：參照課題組前期試驗確定的最優超高壓條件，于25 ℃，200～400 MPa變壓處理18 min(高壓時間∶低壓時間=2∶1)；4 ℃貯存1周后，分析檢測。

參照GB 4789.2—2016測定酒樣菌落總數<50 CFU/mL，符合QB/T 5476—2020對果酒的品質和衛生要求，進而對酒樣進行品質分析。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 理化指標測定

可溶性固形物、總酸、pH、酒精度參照GB/T 15038—2006測定。

1.2.3.2 CIELAB顏色參數測定

參照李寧寧等[5]的方法，紫外-可見分光光度計，以蒸餾水為參比，使用2 mm光程比色皿測定，掃描范圍為400～700 nm，掃描間隔為1 nm。計算CIELAB顏色參數L*(亮度)、a*(紅/綠色度)、b*(黃/藍色度)、色度、色調。

1.2.3.3 香氣成分分析

參照魯榕榕等[6]的方法并略有改動。

富集萃取：準確吸取6 mL樣品于20 mL頂空瓶中，分別加入10 μL的(2-辛醇82.92 μg/L)、1-辛烯-3-酮(82.92 μg/L)、3-羥基己酸乙酯(248.76 μg/L)為內標，1 g NaCl，密封，40 ℃恒溫30 min，插入固相微萃取頭，磁力攪拌下萃取30 min，于GC進樣口230 ℃下解析10 min，GC-MS分析。

GC條件：進樣口溫度230 ℃；不分流進樣，50 ℃保持10 min，以3.0 ℃/min升至180 ℃，保持 6 min；載氣(He)；流速1 mL/min。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；連接桿溫度180 ℃；離子源溫度250 ℃；質譜掃描范圍m/z50～350。

定性：NIST譜庫檢索，結合相對保留指數(retention index，RI)定性。RI根據組分保留時間以及正構烷烴(C6～C21)在相同色譜條件下的保留時間計算，同時與NIST、Wiley質譜庫的相對保留指數對比，差值絕對值小于100的組分可定性為該化合物。

定量：混合內標半定量，香氣成分含量、香氣成活性值(odor activity value,OAV)計算如公式(1)、公式(2)所示：

香氣成分含量/(μg·L-1)

(1)

(2)

1.3 數據處理

Microsoft Excel 2019統計，SPSS Statistics 25.0顯著性分析(Duncan法，P<0.05)，Origin 2018繪圖，Metabo Analyst 5.0主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘法(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)進行判別分析。

2 結果與分析

2.1 加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒可溶性固形物、pH、總酸的影響

酒樣pH值、總酸含量和可溶性固形物含量比較可知(表1)，可溶性固形物含量沒有顯著性變化(P>0.05)；HHP處理酒樣pH值、總酸含量與對照酒樣差異不顯著(P>0.05)，加硫處理酒樣pH值顯著降低、總酸含量顯著增大(P<0.05)，可能是由于加硫處理添加的偏重亞硫酸鈉，水溶液呈酸性，酒樣總酸含量增加，pH值降低[7]。HHP處理對樣品的糖酸含量影響較小，這與于佳琦等[8]的研究一致，優于加硫處理酒樣。

表1 沙棘蜂蜜酒的可溶性固形物、pH和總酸Table 1 Soluble solids, pH and total acid of sea-buckthorn mead

2.2 加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒色澤品質影響

類胡蘿卜素是沙棘漿果呈現亮麗橙色的主要色素，其含量和構成影響沙棘蜂蜜酒的色澤品質。由酒樣色澤品質分析可知(表2)，與對照酒樣相比，加硫處理酒樣L*值、a*值、b*值和色調值沒有顯著變化，色度值顯著增加了2.48%(P<0.05)；HHP處理酒樣L*值(亮度)、a*值(紅綠度)和色調值沒有顯著變化(P>0.05)，但色度值顯著增加了4.0%，b*值(黃藍度)顯著增加1.84%(P<0.05)，說明HHP處理后酒樣顏色更加鮮艷飽滿，優于加硫處理和對照酒樣。HHP處理會引起β-胡蘿卜素晶體分子間范德華力碰撞，π軌道電子斷裂并導致類胡蘿卜素的異構化[9]，使類胡蘿卜素結構改變，同時HHP處理會促使附著在細胞壁聚合結構上或嵌在胞間細胞器中的類胡蘿卜素釋放到基質中[10]，這可能是導致HHP處理酒樣b*值和色度值增加的原因。

表2 沙棘蜂蜜酒的色澤指標Table 2 Color indicators of sea-buckthorn mead

2.3 加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒香氣構成的影響

2.3.1 沙棘蜂蜜酒香氣組分定性、定量分析

香氣是影響沙棘蜂蜜酒風味和品質的重要因素。頂空固相微萃取氣質聯用技術分析檢測試驗酒樣香氣化合物組成(圖1，附表1，表中香氣類型參考馬騰瑧等[11]、孫寶國[12]進行描述)，試驗酒樣共定性、定量88種香氣化合物，主要包括36種酯類、15種醇類、9種脂肪酸類、9種萜烯類、7種醛酮類。HHP處理酒樣定性76種香氣化合物，與對照酒樣共有組分64種。加硫處理酒樣共定性73種香氣化合物，與對照酒樣共有組分60種。3種酒樣的香氣物質種類、含量均存在較大差異。HHP處理酒樣香氣總含量13 505.38 μg/L，加硫處理酒樣香氣總含量7 878.6 μg/L，分別較對照酒樣(10 512.2 μg/L)增加了28.47%和減少了25.05%。

附表1 沙棘蜂蜜酒香氣化合物Enclose Table 1 Aroma components in sea-buckthorn mead

續附表1

圖1 沙棘蜂蜜酒中香氣物質含量的變化Fig.1 Changes in contents of aroma compounds in sea-buckthorn mead注：圖中標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3.2 酒樣香氣構成比較分析

酯類物質是沙棘蜂蜜酒香氣的主要貢獻者，酒樣共檢測到36種，HHP處理酒樣32種、加硫酒樣34種、對照酒樣30種。種類沒有明顯差異，但含量差異顯著，與對照酒樣(9 265.38 μg/L)相比，加硫處理酒樣含量(6 127.5 μg/L)減少了33.87%，其中乙酸酯減少19.32%、乙酯減少35.79%、其他酯減少42.39%；HHP處理酒樣含量(11 549.43 μg/L)較對照增加了24.65%，其中乙酸酯減少21.40%、乙酯增加16.8%、其他酯增加88.24%，DAZ-MAROTO等[13]提出，在葡萄酒陳釀過程中，乙酯類香氣物質含量增加，高壓處理后乙酯類物質含量增加，說明HHP處理對酒樣具有一定的催陳作用。HHP處理酒樣酯類物質含量顯著高于加硫處理和對照酒樣，一方面可能是因為高壓促進了酯合成酶的催化作用[14]，另一方面可能來自HHP處理對反應物的壓縮效應及高壓物理能對化學鍵有影響[15]，進而促進了酯類物質的合成。

酒樣共檢測出7種醛酮類物質。HHP處理酒樣4種、加硫酒樣4種、對照酒樣6種。加硫酒樣(14.64 μg/L)與對照酒樣(15.47 μg/L)的含量沒有顯著性差異，HHP處理酒樣(6.09 μg/L)與對照酒樣相比減少了60.63%，壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛在HHP處理酒樣中沒有檢測到，可能是因為高壓可促使醛氧化為酸類物質[16]。2-壬酮(2.07 μg/L)是超高壓處理酒樣中獨有的物質，賦予酒樣果香和甜香；α-紫羅蘭酮、β-環檸檬醛經HHP處理后較對照酒樣分別增加了30.77%和13.86%，α-紫羅蘭酮是β-胡蘿卜素的降解產物，高壓條件會使類胡蘿卜素中的化學鍵受到破壞[17]，導致酒樣中類胡蘿卜素含量有所降低。醛酮類物質可通過烴類物質降解產生[18]，沙棘蜂蜜酒中醛酮類物質較少，可能是由于醛酮類物質的性狀不穩定，發酵和處理過程中容易被還原成醇或酸等物質[19]。

酒樣共檢測出9種脂肪酸類物質，其中HHP酒樣6種、加硫酒樣8種、對照酒樣5種。對照酒樣含量127.84 μg/L，HHP處理酒樣(193.4 μg/L)較對照增加了51.28%，加硫處理酒樣(196.74 μg/L)增加了53.90%。3種酒樣中辛酸含量最高，HHP、加硫和對照酒樣含量分別為104.76、126.3、90.73 μg/L，其次是己酸，HHP、加硫和對照酒樣含量分別為30.17、27.95、23.24 μg/L。果酒中的有機酸主要是發酵過程中由高級脂肪酸分解或醇、醛氧化的產物[20]，在低濃度時散發出奶酪和水果的風味，高濃度時有脂肪和腐臭味[10]。適當濃度的短鏈酸可以帶來良好的風味，抑制對應芳香酯的水解，對果酒香氣平衡有重要作用[21]。試驗酒樣脂肪酸含量都低于其氣味閾值，對酒樣的香氣影響不大。

酒樣共檢測出9種萜烯類物質，HHP處理酒樣8種、加硫處理酒樣5種、對照酒樣6種。HHP處理和對照酒樣中含量分別為27.26、23.63 μg/L，沒有顯著性差異，但加硫處理酒樣(14.88 μg/L)較對照酒樣下降了37.03%。萜烯類化合物主要是通過其非萜苷類化合物在酒精發酵過程中釋放[22]。HHP處理后芳樟醇、大馬士酮、香茅醇含量較對照酒樣增加顯著，分別增加了20.8%、45.54%、25.95%，尤其反式-橙花叔醇增加了2.56倍。這可能是HHP處理激活了糖苷酶的活性[23]，促進芳樟醇、香茅醇糖苷化合物水解的結果。香茅醇和反式-橙花叔醇在加硫處理酒樣中未檢測出，可能是由于萜烯類物質結構不穩定，易受外界因素影響，發生氧化、還原等反應導致了結構改變[24]。

酒樣中共檢測出15種醇類物質，HHP處理酒樣14種，加硫處理酒樣15種，對照酒樣13種。物質種類沒有明顯差異，但含量差異顯著，對照酒樣含量為959.39 μg/L，HHP處理酒樣(1 528.83 μg/L)較對照增加了59.35%，加硫處理酒樣(1 392.35 μg/L)較對照增加了45.13%。含量最高的是異戊醇，在HHP、加硫和對照酒樣的含量分別為954.11、928.27、867.87 μg/L；苯乙醇經HHP和加硫處理后含量分別為465.39、375.98 μg/L，對照酒樣未檢測到。異戊醇和苯乙醇屬于果酒中常見的醇類物質，分別賦予酒樣果香和花香。2種處理酒樣醇類含量增加，可能是HHP或加硫處理激活了某些糖苷酶的活性，使酒樣中以糖苷類結合的醇類香氣成分得以釋放，醇類物質通過酵母經葡萄糖代謝途徑或氨基酸代謝途徑生成[25]，酒中適量的高級醇使酒體豐滿柔和，圓潤醇厚，增加香氣的復雜性[26]；但含量過高時，會對酒的香氣產生不良影響[27]以及飲后上頭的現象。

2.3.3 HHP處理對低醇沙棘蜂蜜酒主體香氣物質的影響

為了進一步探討HHP和加硫處理對低醇沙棘蜂蜜酒香氣特征的影響，對酒樣中OAV>1的香氣物質進行PCA和PLS-DA(圖2)。

a-沙棘蜂蜜酒香氣物質的PCA；b-沙棘蜂蜜酒香氣物質的PLS-DA圖2 沙棘蜂蜜酒香氣物質的PCA與PLS-DA分析Fig.2 PCA and PLS-DA analysis of aroma substances in sea-buckthorn mead

PCA顯示(圖2-a)，主成分1(PC1)與主成分2(PC2)的貢獻率分別為68%和31.2%，累積貢獻率達到99.2%，可以反映香氣物質的總體變化情況，第一主成分可清楚區分加硫酒樣與HHP酒樣，第二主成分可有效區分對照酒樣與加硫、HHP酒樣，說明HHP和加硫處理對沙棘蜂蜜酒香氣風格影響較大。PLS-DA分析(圖2-b)可知，乙酸庚酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯是受抑菌處理影響最大的3個組分，它們得分均>1.0，其次是苯甲酸乙酯、大馬士酮、玫瑰醚、辛酸乙酯，除了乙酸異戊酯和己酸乙酯，其他5種物質在HHP處理組中含量均高于其他酒樣，說明超高壓處理增強了酒樣果香、玫瑰花香和甜的杏仁味道。加硫處理酒樣含量最高的是正庚醇、反-2-辛烯醛，其余物質含量均低于其他2組，說明加硫處理后酒樣香氣物質損失較大。反-2-辛烯醛在HHP處理酒樣中沒有檢測到，青香感物質的減少也是果酒陳釀的一種表現，再次證明了HHP處理對低醇沙棘蜂蜜酒有催陳和提高香氣品質的作用。

3 結論

試驗比較分析了加硫和HHP兩種處理對低醇沙棘蜂蜜酒品質的影響。結果表明，加硫處理沙棘蜂蜜酒的pH值降低、總酸含量增大；HHP處理酒樣pH值、可溶性固形物和總酸含量沒有顯著性變化。酒樣色澤，加硫處理酒樣色度值增加；HHP處理酒樣b*值和色度值增加。處理樣品香氣總含量與對照酒樣相比，加硫處理酒樣減少了25.05%，HHP處理酒樣增加了28.47%，其中酯類含量增加了24.65%，酒體的果香和花香更加突出。HHP技術應用于低醇沙棘蜂蜜酒生產，可改善酒樣的香氣和色澤品質，是一種優勢顯著的蜂蜜酒發酵后處理技術。