羊痘病毒宿主范圍基因063缺失表達載體的構建

柳璇 ，高娜，王玉婷，張成，李有文*

（1塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）（2新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

羊痘是由羊痘病毒感染山羊、綿羊和牛等反芻動物引起的一種烈性傳染病。病畜以發熱、全身起痘為典型特征［1］，羊群感染后有極高的死亡率，對養羊業及國際貿易造成巨大的經濟損失。羊痘病毒屬的三個成員均表現嚴格的宿主范圍限制，通常只感染相應的本病動物，但近年來羊痘病毒跨物種感染的現象時有報道，甚至有羊痘病毒感染人的報道［2］，說明羊痘病毒的組織嗜性在發生改變，存在跨物種感染或傳播的風險。目前對于痘病毒的研究主要集中在痘苗病毒上，而有關宿主范圍因子（Hrf）的研究才剛起步［3］，對羊痘病毒Hrf的了解也是由痘苗病毒Hrf的同系物推測得到，并無實驗室研究結果。

痘病毒在長期進化過程中，已衍化出一組特有的針對靶細胞抗病毒信號途徑起作用的蛋白，這些蛋白稱之為Hrf，編碼這些Hrf的基因稱為Hrg［3］。痘病毒Hrf與宿主細胞抗病毒之間的互作動態決定其能否發生感染，即Hrf通過調節靶細胞的酶活性，抑制細胞凋亡，對抗干擾素作用等，為病毒的增值提供適宜的微環境。目前對于痘病毒Hrf調控干擾素的機制較為清楚，但對宿主細胞其他信號通路的調控還需深入研究［4］。有研究發現，已知的多種痘病毒的Hrf不僅影響病毒的毒力，而且決定了感染宿主的范圍［5］。到目前為止，已經發現15個基因具有痘病毒宿主范圍功能，根據功能特征將其分成12個基因家族，但沒有一個Hrg同時存在于所有痘病毒中［6］。

羊痘病毒063基因是痘苗病毒Hrf C7L的同系物［5］，因此推斷063基因可能是羊痘病毒的Hrf，但還需進一步證實。羊痘病毒063基因位于病毒基因組的核心區域，一般認為核心區域基因的功能主要與病毒生長繁殖必需的功能蛋白表達有關，而兩側翼區的基因則主要表達與病毒毒力和宿主范圍有關的蛋白［7］，因此位于核心區的063基因成為Hrg以及其所起的作用就成為很多學者關注的問題。為了研究063基因Hrf的功能及生物特性，構建063基因缺失的重組羊痘病毒非常關鍵。本研究構建了Hrf 063基因缺失的表達載體，通過同源重組得到了063基因缺失的重組羊痘病毒，雖未得到純化的重組病毒，但初步了解了羊痘病毒063基因的生物學特性，為進一步研究羊痘病毒Hrf奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株、菌株和細胞

PEGFP-SP質粒、克隆載體PEASY-T1 Cloning-Vector、大腸桿菌DH5α感受態細胞、羔羊睪丸原代細胞和課題組前期收藏的山羊痘病毒SS株、TS株以及疫苗株均保藏于塔里木大學畜牧科技重點實驗室。

1.1.2 主要藥品及試劑

2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker，購自大連寶生物科技有限公司；PEASY-T1 Cloning Vector載體，購自北京全式金生物技術有限公司；BamHI、XhoI限制性內切酶、Golden View/loading buffer，購自Thermo公司；DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒，購自北京天根生物工程技術服務有限公司。

1.1.3 主要使用儀器

SW-CJ-2FD超凈工作臺（上海博訊實業有限公司），小型臺式微量離心機（eppendorf），梯度PCR儀（Bio-Rad生命科學有限公司），DYY-7C型瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠），GEL DOC XR+凝膠成像系統（Bio-Rad生命科學有限公司），ZXGPB2160隔水恒溫式培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司），ZWYR-200D臺式恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

根據GenBank中已公布的山羊痘病毒Pellor株（GeneID：5228351)中063基因60 bp的側翼序列及GFP序列，運用Primer Premie 6.0軟件設計overlap PCR特異引物，并將其送至武漢天一輝遠生物有限公司進行合成，引物序列如表1所示。

表1 特異引物

1.2.2 GFPΔ063基因擴增、鑒定與回收

PCR擴增反應體系：濃度為10 μmol/L的上下游引物各2.4 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 50 μL，模板（PEGFP-SP質粒）6 μL，ddH2O 39.2 μL，總反應體系100 μL。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；50 ℃30 s；72 ℃ 90 s；35個總循環；72 ℃ 10 min；12℃自動保存。反應結束后將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，用實驗室購買的DNA純化回收試劑盒（按照說明書進行操作）回收所需要的目的基因片段。

1.2.3 基因缺失表達載體的構建

將回收的GFPΔ063基因與PEASY-T1 CloningVector載體按照下列體系進行連接反應：GFPΔ0634 μL，載體（PEASY-T1 Cloning Vector）0.5 μL，ddH2O 0.5 μL，反應總體系5 μL，在梯度PCR儀中25℃控溫連接30 min。將連接產物轉化于大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于AMP抗性的培養基上過夜培養，挑取單菌落進行菌液PCR初步鑒定，對陽性菌落搖菌培養提取質粒（按照質粒小提試劑盒說明書操作）。

1.2.4 重組質粒的雙酶切鑒定

將提取的PEASY-Δ063-GFP重組質粒分別使用限制性內切酶BamHI、XhoI 37℃水浴酶切3～4 h。酶切體系：質粒5 μL，Thermo Scientific10×Buffer Tango 1 μL，BamHI、XhoI各 0.5 μL，ddH2O 3 μL，總反應體系10 μL，反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經酶切鑒定正確的質粒送去武漢天一輝遠生物有限公司測序。

1.2.5 病毒重組

復蘇一支凍存的羔羊睪丸原代細胞，生長良好后傳代于12孔細胞培養板中，在37℃、5%的CO2培養箱中培養，培養至單層細胞長至80%～90%時，吸取培養液，用PBS洗3次。接種山羊痘病毒10 μL（IgTCID50=10-4.375/0.1 mL），37 ℃吸附1 h，吸棄病毒液，加入含2%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基，在37℃、5%的CO2培養箱中培養12 h。用脂質體Lipofectamine 2000轉染PEASY-Δ063-GFP重組質粒，參考米麗開姆·托合提尼亞孜［8］的方法，并于轉染后24 h、36 h、48 h分別置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況，并挑取熒光斑點。

1.2.6 重組病毒的純化篩選

將以上重組的063基因缺失帶熒光的SS株、TS株和疫苗株重組病毒分別進行10-1～10-10的倍比稀釋，分別接種至培養密度90%的羔羊睪丸原代細胞，添加含有2%FBS和100 ug/mL雙抗的DMEM培養基，在37℃、5% 的CO2培養箱中培養2～3 d，并適時觀察，待最強熒光斑點出現，吸取上清液，加入用2%FBS的DMEM培養基配制的低熔點瓊脂糖固定，在倒置熒光顯微鏡下挑取帶有熒光的斑點，特別是高稀釋倍數孔中的熒光斑點，反復凍融后，將帶熒光培養物進行倍比稀釋，再接種羔羊睪丸原代細胞，挑取熒光，如此重復至重組病毒純化。

2 結果

2.1 GFPΔ063基因PCR擴增鑒定

GFPΔ063基因PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳儀鑒定得到大小為900 bp條帶，與預測結果一致（如圖1所示）。

圖1 羊痘病毒GFPΔ063基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果

2.2 重組質粒的雙酶切鑒定

將GFPΔ063基因與載體的連接產物經菌液PCR鑒定陽性的PEASY-Δ063-GFP重組質粒做BamHI、XhoI雙酶切鑒定，電泳結果顯示有4000 bp與900 bp大小的兩個條帶（如圖2所示），與理論相符，測序結果表明載體構建正確。

圖2 羊痘病毒PEASY-Δ063-GFP重組質粒雙酶切鑒定結果

2.3 病毒重組、重組病毒純化篩選

1）將培養好的羔羊睪丸原代細胞在12孔細胞板中傳代，培養至單層細胞密度為80%～90%，細胞呈梭形貼壁生長時（如圖3所示），接種山羊痘病毒，培養48 h后，細胞形態拉長、間隙變大，病毒在細胞中生長良好（如圖4所示）。

圖3 羔羊睪丸原代細胞培養結果

圖4 接種山羊痘病毒的羔羊睪丸原代細胞培養結果

2）將PEASY-Δ063-GFP重組質粒轉染到羊痘病毒感染的羔羊睪丸原代細胞中，5～6 h后換液，分別在12 h、24 h、48 h觀察重組結果。發現只有PEASY-Δ063-GFP重組質粒轉入羊痘病毒感染的羔羊睪丸原代細胞得到了熒光場帶有熒光斑點的SS株、TS株、疫苗株063基因缺失的重組病毒（如圖5所示）。挑取倒置顯微鏡下帶有熒光的重組病毒斑點，倍比稀釋后接種細胞傳代純化重組病毒。結果傳代病毒沒有表達熒光，表明重組病毒傳代無法形成子代病毒，最終未能得到純化的重組病毒。

圖5 SS株、TS株、疫苗株063基因缺失的重組病毒結果

3 討論

本研究根據已在GenBank上發表的山羊痘病毒株（登錄號為NC004003.1）中063基因序列及其兩側的側翼序列（約60 bp）與GFP基因上下游特異引物組成overlap PCR的引物，擴增GFP基因，將其插入克隆載體中作為構建重組病毒表達載體的報告基因。這種構建方法是直接用報告基因GFP替換掉了063基因，以063基因本身的啟動子作為重組病毒報告系統的啟動子，一方面簡化構建過程，不需要專門擴增克隆報告基因的啟動子；另一方面GFP作為報告基因，其表達的熒光容易觀察，只要在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光就可以證明重組成功。

一般認為在構建重組表達載體時，同源臂越長重組效率越高，但同源臂越長，構建過程也會越復雜。楊勇飛等［9］研究ANK基因時選用約300 bp的同源臂，用Overlap PCR的方法經過3步擴增才得到報告系統。本研究中用了約60 bp的同源臂，利用Overlap PCR的方法1步就得到了報告基因系統，較大的簡化了步驟。重組結果顯示，本次構建的重組病毒表達載體轉染羊痘病毒感染的羔羊睪丸原代細胞后，得到大量帶有綠色熒光的細胞，且熒光強度較高，說明表達載體與病毒基因組發生了重組，并使報告基因得到了表達，此結果甚至比楊勇飛等［9］選用同源臂為300 bp表達載體重組的效率還要高，說明對構建同源重組病毒來講，同源臂的長度達到60 bp就可以構建成功。同源重組中同源臂的長度不是影響重組效率的絕對因素，可能同源臂的相似性、目的基因的特性起著更為重要的作用，在重組病毒時需要全面分析。

另外，重組病毒的穩定性對于得到一株重組病毒非常重要。在本研究中，063基因的重組表達載體雖然轉染后得到了高效表達的GFP，且在3個羊痘病毒株上得到了相同的結果，但當挑取熒光斑點進行傳代純化時卻無法得到表達的熒光和純化的063基因缺失的重組病毒。經分析認為可能與063基因本身的生物學特性有關系，該基因位于病毒基因組核心區，若被破壞或缺失可能會導致病毒不能正常生長繁殖，或者基因組中編碼結構蛋白的區域被敲除，使病毒缺失了增殖所必需的衣殼或囊膜，從而直接導致病毒不能正常出膜［10］，不能形成子代病毒；也可能與決定病毒的細胞嗜性方面有關。前人通過粘液瘤病毒C7L同源序列的M062R、M063R和M064R的敲除試驗表明，M063R的缺失影響病毒在兔源細胞系的復制，而M062R缺失影響其在BG-MK、RK13、RL-5和人源細胞中的復制［11-12］。經重組病毒研究證實，重組M062RDE VACV（C7L和K1L缺失性）可以拯救M062RDE VACV在鼠3T3、Hela和A431細胞中的復制，但無法實現M063R和M064R的復制，表明這三者在決定病毒的細胞嗜性方面存在差異［13］，這種嗜性不僅受病毒自身編碼的Hrf決定，也與病原和宿主間的相互作用有關［5］。本研究中063基因缺失的重組病毒，可能因063 Hrg缺失而影響了病毒增值的功能，降低了病毒對細胞的嗜性，導致重組病毒不能正常形成子代病毒。幾乎所有的痘病毒都能結合并入侵哺乳動物細胞，其入胞后下游的一系列胞內事件決定了病毒復制的限制性［14-15］。

相比較張雪萍［16］和米麗開姆·托合提尼亞孜［8］使用同樣的方法分別得到了ANK141.2基因和KLP2基因缺失并純化的重組羊痘病毒，二者均為病毒側翼區的非必需基因，能在傳代純化中正常增值形成子代病毒。位于核心區063基因可能因其是Hrg，該基因缺失將導致重組病毒無法正常傳代純化，形成子代病毒，但在重組表達載體轉染被羊痘病毒感染的細胞后能夠產生大量帶熒光的細胞，可能是重組表達載體中的報告基因在細胞中與羊痘病毒基因組發生了重組，并且該重組的基因片段也在病毒自身酶調節和細胞的表達系統中進行了轉錄和翻譯并表達出了GFP，但在病毒包裝出膜的過程中，重組的基因能否被順利包裝形成成熟的病毒粒子，在形成的病毒粒子中能否正常發揮生物功能都無法確定，也可能是重組病毒在子代復制重組時和之前感染細胞的病毒發生了重組形成返祖結果［17］，出現了與本研究一樣的結果。表明，構建重組病毒時，初次轉染就能觀察到病毒重組的現象并不困難，但是能夠得到傳代并純化的重組病毒才更為重要。

4 結論

本研究成功構建了Hrg 063缺失的表達載體PEASY-Δ063-GFP，表達載體經轉染篩選得到了063基因缺失的山羊病毒SS株、TS株和疫苗株3個毒株重組病毒，但重組病毒卻不能正常傳代，無法得到純化的重組病毒。063基因缺失表達載體的構建為063基因生物學功能的研究奠定了基礎。