pH調控Y型分子篩負載阿霉素納米藥物制備及與MM?231細胞的作用

任 晶 閆錦慧 張安懿 閆宇星 王存存 李 林,2

(1太原師范學院化學系，晉中 030619)

(2山西省腐植酸工程技術研究中心，晉中 030619)

0 引 言

乳腺癌具有患者年輕化、發病率及死亡率高的特點，不僅威脅到個人身體健康和生命安全，而且嚴重影響我國乃至世界經濟、社會發展[1]。國際癌癥研究機構(IARC)2020年2月發布了全球癌癥統計報告，這份報告顯示乳腺癌排在女性罹患癌癥的第一位。據IARC估計，到2040年全球乳腺癌確診患者人數將達到310萬[2]。目前，手術和化療是治療乳腺癌最常用的方法[3?4]。然而，化療雖可殺滅腫瘤細胞，但在治療過程中，患者會出現身體疲乏、心臟中毒、肝功異常等情況，嚴重影響患者生活質量，限制其在臨床上的廣泛應用[5?6]。為了提供最優化的腫瘤患者給藥治療方式，20世紀60年代中期研究者提出了藥物緩釋及靶向性治療策略[7]。即利用腫瘤和正常組織之間的高通透、高滯留(EPR)效應、pH值差異性、谷胱甘肽含量不同等區別，將藥物定向轉運到腫瘤組織，實現藥物對正常細胞的低毒副作用，從而有效提高癌癥治療效率[8?13]。

納米技術的出現為早日攻克癌癥提供了新的視野，利用納米材料的優勢將抗癌藥物阿霉素(DOX，結構見圖1)、順鉑、甲氨蝶呤、紫杉醇等設計為負載藥物輸送體系已經成為研究熱潮[14?20]。例如：Rao等設計、合成了兩親性嵌段聚合物負載DOX的納米藥物輸送體系(COPY?DOX)，并且研究了它的抗腫瘤功效[21]。Fan等把水分散性好的富勒烯作為納米載體，制備出多功能性抗腫瘤前藥體系，該體系有主動靶向性、光動力治療和pH響應化療3個特性[22]。盡管納米藥物輸送體系已經被大量開發，但其在腫瘤微環境中釋放藥物的特性卻不盡如人意，并且其抗腫瘤效果也比游離的DOX弱，且生物相容性也有待繼續研究。

圖1 DOX的結構Fig.1 Structure of DOX

Vallet?Regi等于2001年首次提出硅基介孔材料能夠用于藥物緩釋，之后科研人員就展開了大量研究[23]。如探究介孔載體表面性質、孔徑、形貌等對其載藥釋藥性能影響[24?26]。分子篩孔道均勻、表面基團豐富、穩定性高和無毒等特點使其在生物醫藥方面的應用備受關注[27?30]。綜合各項研究成果發現：介孔分子篩不僅可以作為藥物載體成為臨床上的首選納米材料，而且還提供了安全保障，這一點對臨床醫學至關重要。如Wen等研究了ZSM?5負載DOX以及pH對藥物釋放的影響[31]；Abasian等研究了PLA/chitosan/NaX/Fe3O4/DOX納米纖維復合物對H1355細胞的殺傷力作用，結果表明其可有效殺死75%的腫瘤細胞[32]。雖然上述分子篩-DOX納米藥物體系均取得一定成效，但其藥物負載量還不是令人十分滿意，且其合成過程繁瑣，生物相容性及抗腫瘤效率還有待提高。

為了得到一種制備過程綠色簡單，且具有高負載率和低毒副作用的分子篩納米藥物，我們以Y型分子篩(YMS)作為基體，通過不同pH、不同負載時間和不同DOX加入量等實驗探究最佳負載條件，將DOX借助氫鍵和范德華力等負載在YMS上制備出高負載納米藥物體系(YMS?DOX)。對YMS和YMS?DOX進行了功能基團、粒徑和電位等表征，證實YMS?DOX藥物體系成功制備。以人乳腺癌細胞(MM?231)和樹突細胞(DC)為模型，經細胞毒性試驗和流式細胞術測試表明，YMS?DOX具有緩釋藥物作用，能有效殺死腫瘤細胞，且可降低對正常細胞的毒副作用。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

YMS(粒徑約200 nm)由太原理工大學贈送。檸檬酸(C6H10O8)和磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)購自上海阿拉丁試劑有限公司。DOX購自合肥博美生物科技有限責任公司。MM?231和DC細胞由山西醫科大學提供。3?(4，5?二甲基噻唑?2)?2，5?二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 YMS?DOX納米藥物制備及DOX負載量測定

稱取1.0 mg YMS[33]，首先用無水乙醇超聲高速離心洗滌2次，隨后加入1.0 mL pH=9.0的緩沖溶液(C6H10O8和 Na2HPO4·12H2O 調配)，超聲分散 0.5 h。接著加入0.2 mg DOX，混合均勻后置于WIGGENS(WH220?R)型紅外線加熱電磁攪拌器(德國)上室溫反應20.0 h。待反應結束，高速離心并用去離子水洗滌2～3次，直到上清液接近無色為止。待洗滌完畢，將YMS?DOX納米顆粒用冷凍干燥機干燥備用，用棕色試劑瓶收集所有洗滌液，避光儲存，此YMS?DOX為最佳制備條件所得樣品。

借助UV?Vis吸收光譜法[34]和標準曲線計算DOX負載量。在2.0 mL的EP管中將1.0 mg·mL-1的DOX溶液用pH=9.0的緩沖液依次稀釋到10、20、30、40、50、60 μg·mL-1。然后用紫外可見分光光度計檢測DOX的吸光度，以吸光度值為縱坐標，DOX濃度為橫坐標，繪制DOX的標準曲線。

1.3 pH、作用時間和加入量對YMS?DOX負載量的影響

稱取10份1.0 mg的YMS，首先用無水乙醇超聲高速離心洗滌2次，隨后分別加入1.0 mL pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的緩沖溶液(C6H10O8和Na2HPO4·12H2O調配)，超聲分散0.5 h。接著加入0.2 mg DOX，混合均勻后置于紅外線加熱電磁攪拌器上室溫反應20.0 h。待反應結束，高速離心并用去離子水洗滌2～3次，直到上清液接近無色為止。將YMS?DOX納米顆粒置于冷凍干燥機干燥備用，用棕色試劑瓶收集所有洗滌液，避光儲存。通過測定DOX在480 nm處吸光度，利用εDOX=11 500 L·mol-1·cm-1計算出上清液中 DOX 含量，DOX加入總量與上清液中DOX含量的差值即為YMS中DOX負載量。

稱取5份1.0 mg的YMS，首先用無水乙醇超聲高速離心洗滌2次，隨后加入1.0 mL pH=9.0的緩沖溶液(C6H10O8和Na2HPO4·12H2O調配)，超聲分散0.5 h。接著加入0.2 mg DOX，混合均勻后置于紅外線加熱電磁攪拌器上室溫下依次反應0.5、1.0、4.0、12.0和20.0 h，待反應結束，后續操作如上所述。

稱取6份1.0 mg的YMS，首先用無水乙醇超聲高速離心洗滌2次，隨后加入1.0 mL pH=9.0的緩沖溶液(C6H10O8和Na2HPO4·12H2O調配)，超聲分散0.5 h。隨后依次分別加入0.1、0.2、0.4、0.5、0.8和1.0 mg的DOX，混合均勻后置于紅外線加熱電磁攪拌器上室溫反應20.0 h，待反應結束，后續按上述操作處理。

1.4 YMS?DOX納米藥物形貌、粒徑和光譜表征

取少量YMS和按照最佳條件制備得到的YMS?DOX(下同，不再特別說明)加入無水乙醇中，超聲分散0.5 h后，將樣品分別滴至數個銅網上，風干，借助FEI Tecnai F30型透射電子顯微鏡(TEM，荷蘭)對其形貌進行觀察，加速電壓200 kV。

取少量YMS和YMS?DOX加入到蒸餾水中，超聲分散0.5 h后，利用Nano ZS90馬爾文激光粒度散射儀(英國)于25℃和90°測其粒徑和ζ電位。

取YMS、YMS?DOX和DOX分別加入到磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，超聲分散0.5 h，隨后借助日立U?3900紫外可見吸收光譜儀(日本)測定其吸光度，掃描范圍為800～200 nm。借助日立F?7000熒光光譜儀(日本)測定其熒光光譜圖，設置激發波長為480 nm，發射波長掃描范圍為500～700 nm，狹縫均設為5 nm。取冷凍干燥好的YMS?DOX與KBr混合，研磨壓片，采用熱電Nicolet Is5型紅外光譜儀(美國)表征樣品骨架結構，判斷YMS負載DOX是否成功。

取少量干燥好的YMS和YMS?DOX研磨成粉末，借助理學Rigaku Ultima Ⅳ型X射線衍射儀(XRD，日本)測定樣品結構，采用Cu靶Kα射線(λ=0.154 18 nm)，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描步長0.02°，掃描范圍10°～80°。

1.5 YMS?DOX納米藥物體外釋藥

稱取4份1.0 mg YMS?DOX納米藥物，分別加入1.0 mL pH為4.5、5.5、6.5和7.4的PBS，超聲分散0.5 h后，移入透析袋中，兩端封口，隨后將透析袋置于分別裝有9.0 mL相對應的PBS的50.0 mL離心管中，避光置于恒溫振蕩儀中孵育(溫度37.0℃，轉速150.0 r·min-1)。按照設定的不同時間間隔從離心管中取出2.0 mL透析液，按照文獻方法[33]測定DOX負載量，待測定結束后，再將2.0 mL透析液轉移回離心管中，重復上述操作，待48.0 h后，計算并繪制藥物釋放累積曲線。

1.6 YMS?DOX細胞毒性和凋亡測試

將處于對數生長期的MM?231和DC細胞按每孔5.0×103個細胞分別接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，分別加入含不同質量濃度的YMS、YMS?DOX和DOX的培養液繼續孵育培養，每組以未處理的細胞作為空白對照，分別培養24、48、72、96 h后，采用MTT法，測試細胞存活率[35]。

將處于對數生長期的MM?231細胞以每盤2.0×105個細胞分別接種于35.0 mm培養皿中，孵育過夜。待細胞貼壁后，分別加入含YMS(25.1 μg·mL-1)、YMS?DOX(25.1 μg·mL-1，等量于 5.0 μg·mL-1DOX)和 DOX(5.0 μg·mL-1)的培養液繼續孵育 72 h。待孵育結束，用0.25%胰酶消化，離心(1 000 r·min-1)5.0 min，收集細胞，加入凋亡檢測試劑，隨后借助流式細胞儀測定[36]。

2 結果與討論

2.1 YMS?DOX的制備及DOX負載量測定

為設計和開發出高負載、低毒副作用、高療效以及低成本的分子篩藥物輸送體系，我們以pH=9.0的緩沖溶液作為反應介質，將YMS與DOX混合，通過物理吸附作用制備得到高負載納米藥物體系(圖2)。由于DOX的pKa=8.3，反應介質的pH=9.0，DOX的氨基在反應介質中以—NH2形式存在，而YMS表面有—OH，DOX分子中的—NH2與YMS分子表面的—OH可通過范德華力和氫鍵相結合[34]，即得到YMS?DOX納米藥物。

圖2 YMS?DOX用于腫瘤藥物輸送示意圖Fig.2 Scheme of YMS?DOX nanomedicine for drug delivery

DOX負載量的測定通過UV?Vis吸收光譜法進行。首先通過標準曲線得到DOX的吸光度(A)與其濃度(c)的關系。圖3A為DOX的UV?Vis譜圖，圖3B為DOX標準曲線。由圖可知，DOX在0～60 μg·mL-1范圍內的吸光度與濃度有很好的線性關系，線性回歸方程為A=0.013 08c+0.027 61，R2=0.994 1。利用該標準曲線，可以計算得到在pH=9.0時YMS對DOX的負載量。

圖3 DOX在緩沖液中的UV?Vis譜圖(A)和標準曲線(B)Fig.3 UV?Vis spectra(A)and standard curve(B)of DOX in buffer solution

之后，我們探究了pH對DOX負載量(根據εDOX計算)的影響(圖4A和4B)。由圖可知，在pH=3～12范圍內，DOX的負載量隨pH增大呈現出先增大后減小的趨勢，當pH=9.0時，DOX負載量達到最大。由于DOX的摩爾吸光系數在不同介質中有細微的差別，當確定了最佳pH后，為了排除此細微影響，使pH=9.0的最佳條件下DOX的負載量數據更加準確，我們利用標準曲線計算pH=9.0條件下，不同時間和加入量對負載量的影響。如圖4C和4D所示，DOX負載量隨時間延長而增加，20.0 h后負載量達到最大，該吸附動力學可較好地擬合為假一級動力學，速率常數為0.122 h-1。圖4E和4F顯示了DOX加入量對DOX負載量的影響。由圖可知，pH=9.0時，DOX負載量隨DOX加入量增加而增加，且呈現出很好的線性關系(Y=0.993 5c+0.436 9，R2=0.999 9)。當 DOX 加入量為 200 μg時，YMS負載DOX量為(199.22±1.98)μg·mg-1，DOX負載率可高達99.61%。

圖4 pH對YMS負載DOX的影響(A、B);pH=9時,時間(C、D)及DOX加入量(E、F)對YMS負載DOX的影響Fig.4 Effect of pH on YMS loading DOX(A,B);Time(C,D)and the amount of added DOX(E,F)on YMS loading DOX when pH=9

2.2 YMS?DOX的表征

利用XRD對YMS和YMS?DOX進行表征，結果如圖 5A 所示。圖中位于 10.35°、15.81°、20.43°、23.85°、27.21°、31.39°、32.47°的衍射峰與文獻報道一致[31]，表明所制備的YMS純度較好。在負載DOX后(圖5B)，上述位置的衍射峰依然存在，說明YMS的立方結構沒有發生大的改變；然而，衍射峰的銳度略有下降，表明與純YMS相比，負載DOX后YMS的結晶度有所降低。

圖5 YMS(A)和YMS?DOX(B)的XRD圖Fig.5 XRD patterns of YMS(A)and YMS?DOX(B)

此外利用TEM對YMS和YMS?DOX的形貌進行了觀察(圖6)，由圖可看到，YMS在吸附DOX之前，呈現出清晰的孔道，在吸附DOX之后，孔道模糊，表面出現黑點，表明YMS?DOX納米藥物成功制備。

圖6 YMS和YMS?DOX的TEM圖Fig.6 TEM images of YMS and YMS?DOX

此外，通過馬爾文粒度儀分別測定了YMS和YMS?DOX的粒徑大小和ζ電位，結果見圖7。我們發現與YMS粒徑相比，YMS?DOX粒徑增大到了約500.0 nm，這可能是由于DOX在堿性條件下會發生自聚集形成DOX納米顆粒，附著于YMS表面，使其粒徑發生一個大的改變。YMS負載DOX前后的ζ電位分別為(-33.2±0.23)mV和(-29.5±0.12)mV，這可能是由于DOX與YMS發生靜電引力作用，消耗了YMS表面羥基，所以表面電位增大，上述結論表明DOX成功負載在YMS表面。

圖7 YMS(A)和YMS?DOX(B)的粒徑;YMS和YMS?DOX的ζ電位 (C)Fig.7 Particle sizes of YMS(A)and YMS?DOX(B);ζ potentials of YMS and YMS?DOX(C)

YMS、DOX和YMS?DOX的UV?Vis譜圖如圖8A所示。YMS?DOX在480 nm處有一個小的DOX特征峰，證實了YMS?DOX成功制備。圖8B是YMS?DOX的紅外光譜圖，其中3 456 cm-1處為—OH的伸縮振動峰，1 487 cm-1處為—NH2的伸縮振動峰，1 471 cm-1處出現了DOX的特征伸縮振動峰，由此說明DOX已經成功負載在YMS上。三者的熒光光譜如圖8C所示，游離的DOX熒光強度很大，但是負載到YMS上之后，YMS?DOX的熒光強度減弱，這是熒光共振能量轉移造成的，這也證實了YMS?DOX的成功制備。

圖8 YMS、DOX和YMS?DOX的UV?Vis(A)、紅外 (B)和熒光 (C)譜圖Fig.8 UV?Vis(A),FT?IR(B),and fluorescence(C)spectra of YMS,DOX,and YMS?DOX

2.3 YMS?DOX的體外釋藥

為了驗證YMS?DOX藥物釋放是否也受pH調控，采用體外透析法研究了其藥物釋放行為，結果如圖9所示。由圖可知，經過48.0 h后，YMS?DOX在pH=7.4(模擬生理環境)時藥物釋放率約為12.0%，而隨著酸性逐漸增強，DOX釋放量逐漸增加，且先呈現出一個藥物快速釋放過程，隨后進入緩釋狀態，擬合得出釋放速率常數kd為0.134 h-1，半衰期t1/2為5.2 h，而游離DOX的t1/2為0.37 h，前者約為后者的14倍，表明YMS?DOX具有較好的藥物緩釋特性。此外在pH=4.5的酸性環境中(模擬腫瘤細胞內環境)，藥物釋放率達到約46.0%，是pH=7.4條件下的3.8倍，這是由于在腫瘤酸性環境中，范德華力作用和氫鍵可被H+破壞，從而使YMS高效大量釋放DOX。上述結果表明，與游離DOX相比，YMS?DOX可顯著降低對正常組織的毒副作用。

圖9 YMS?DOX納米藥物的體外藥物釋放曲線Fig.9 In vitro drug release curves of YMS?DOX nanomedicine

2.4 YMS?DOX的細胞毒性及凋亡測試

通過MTT法測試細胞毒性，探究不同時間、不同濃度下YMS?DOX作用于MM?231和DC細胞，對各自細胞殺傷率的影響，如圖10所示。可以看出，隨著作用時間和濃度的增加，YMS?DOX對MM?231的殺傷率逐漸上升。當濃度為2.8 μg·mL-1時，殺傷率最強。如圖11所示，相比于DOX，YMS?DOX對DC細胞的細胞殺傷率有所下降，說明YMS?DOX可降低DOX對正常細胞的殺傷力。

通過流式細胞術進行細胞凋亡檢測，如圖12所示。圖12A為納米載體YMS對細胞凋亡的影響，結果發現并未引起細胞顯著凋亡，與空白細胞組(圖12D)大致相同，表明YMS具有高生物兼容性；反觀YMS?DOX(圖 12B)和 DOX(圖 12C)均引起大量細胞凋亡，且主要誘導細胞晚期凋亡。圖12E為細胞凋亡柱狀圖，當孵育處理細胞時間為72.0 h時，YMS?DOX引起75.6%的細胞凋亡，DOX為66.3%，這一現象表明YMS?DOX能有效提高DOX對腫瘤細胞的凋亡誘導作用，且具有緩釋功效，從而提高腫瘤治療功效。這一結論與細胞毒性測試相一致。

圖10 YMS(A)、YMS?DOX(B)和DOX(C)對MM?231細胞的MTT毒性測試Fig.10 Effects of YMS(A),YMS?DOX(B),and DOX(C)on MM?231 cells viability by MTT assay

圖11 YMS(A)、YMS?DOX(B)和DOX(C)對DC細胞的MTT毒性測試Fig.11 Effects of YMS(A),YMS?DOX(B),and DOX(C)on DC cells viability by MTT assay

圖12 (A)YMS、(B)YMS?DOX和(C)DOX對MM?231細胞的凋亡測試及(D)作為對照組的未處理細胞;(E)根據(A～D)的數據所作細胞凋亡柱狀圖Fig.12 Cell apoptosis of MM?231 cells treated with(A)YMS,(B)YMS?DOX,and(C)DOX for 72.0 h,and(D)MM?231 cells untreated as control;(E)Cell apoptosis histogram for(A?D)

3 結論

借助氫鍵和范德華力等作用力，通過綠色簡單的方法制備出pH調控的滿足EPR效應的Y型分子篩高負載納米藥物。探究了pH、時間和DOX加入量對YMS負載DOX的影響，發現在pH=9.0，DOX加入量為0.2 mg且負載時間為20.0 h的最佳條件下，負載率可高達99.61%。體外藥物釋放研究發現，YMS?DOX可將DOX大量釋放于腫瘤組織，而在正常組織中釋藥率低，暗示其可有效殺死腫瘤細胞。通過流式細胞術研究了YMS?DOX對MM?231細胞凋亡的影響，結果發現YMS?DOX可將藥物緩慢釋放于細胞內，進而誘導細胞凋亡，表明其具有良好的細胞殺傷力。綜上，我們介紹了一種基于分子篩的腫瘤可激活藥物傳輸體系，為高負載納米藥物體系的合成提供了新的設計思路和理論支持。