穿心蓮內(nèi)酯對小鼠乳腺癌的抑制作用和機制

鹿蓓蓓，傅鶴秀，Eric Achiborebador Okrah，郭文潔，高 靜

(1. 江蘇大學藥學院，線粒體與神經(jīng)生物學實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南京大學生命科學學院，江蘇 南京 210023)

乳腺癌是威脅全球女性癌癥患者健康的惡性腫瘤之一，據(jù)2020年國際癌癥研究機構(gòu)最新數(shù)據(jù)顯示[1]，在癌癥分布類型上，乳腺癌新增人數(shù)達226萬，成為全球第一大癌，且乳腺癌的發(fā)病率及死亡率仍高居女性癌癥首位。癌癥的代謝重編程被認為是許多惡性腫瘤的標志，近年來，對腫瘤代謝的廣泛研究產(chǎn)生了許多旨在破壞這種代謝重編程的新的藥物靶標和其他治療策略[2]。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，Andro)是我國傳統(tǒng)中草藥穿心蓮的主要活性成分之一，具有抗炎[3]、抗菌[4]、抗癌[5]等多方面藥理作用。但關(guān)于穿心蓮內(nèi)酯在體抑制乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及其線粒體相關(guān)機制未見報道。本文擬探討穿心蓮內(nèi)酯對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用，并探討其能量代謝相關(guān)的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及動物小鼠乳腺癌細胞株4T1，由江蘇大學龔愛華教授惠贈。SPF級雌性BALB/c小鼠24只，(6～8)周齡，體質(zhì)量(18～20)g，江蘇大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2018-0012。

1.2 藥品與試劑穿心蓮內(nèi)酯，由江西青峰藥業(yè)提供；RPMI 1640培養(yǎng)基(31800022)，美國Gibco公司；胎牛血清(11011-8611)，浙江天杭生物科技股份有限公司；MTT，美國Amresco公司；5-Fu(F6173)，上海麥克林生化科技有限公司；乳酸(LD)測試盒(A019-2-1)，南京建成生物工程研究所；乙酰輔酶A檢測試劑盒(ML712805)，MLBIO酶聯(lián)生物；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(P0018S)，碧云天生物技術(shù)公司；JC-1，美國Thermo Fisher Scientific公司；一抗(β-actin、PDH)、鼠二抗，美國Proteintech公司；其余未特殊注明的試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；Spectra MaxGemini酶標儀，美國Molecular Device公司；Sigma1-13高速臺式離心機，德國Sigma公司；TS100 Nikon倒置相差顯微鏡、Ti-E活細胞工作站顯微鏡，日本Nikon公司；Bio-RAD 525電泳儀，美國Bio-RAD公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學儀器公司；Clark氧電極，英國Hansatech公司。

1.4 MTT法檢測細胞活性用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細胞并計數(shù)，然后接種于96孔培養(yǎng)板中，密度為4×107L-1，每孔100 μL。待細胞貼壁達到80%后，用不同濃度的Andro(5、10、20、40、80 μmol·L-1)處理細胞24 h，去上清，每孔加100 μL D-Hanks稀釋的MTT(1 g·L-1)，繼續(xù)在孵箱中培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加100 μL DMSO，搖床上搖至沉淀溶解，用酶標儀在570 nm處檢測吸光值，計算細胞活性。

存活細胞/%=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.5 小鼠荷瘤模型的構(gòu)建及給藥常規(guī)方法培養(yǎng)4T1細胞至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度為1×1010L-1，于小鼠第四乳房墊接種細胞懸液0.125 mL；接種后，每天觀察小鼠狀態(tài)及接種部位生長情況，腫瘤出現(xiàn)即為建模成功。將24只建模成功的小鼠隨機分為4組，即Control組、5-Fu(20 mg·kg-1)組、Andro 5 mg·kg-1組、Andro 10 mg·kg-1組，每組6只。腹腔注射給藥，Control組及Andro治療組每天1次；5-Fu組前6 d每天1次，之后每2天1次，共給藥10 d。

最后1 d小鼠稱重后，眼球取血(血樣行1.8檢測乳酸含量)，頸椎脫臼處死小鼠，剖取腫瘤、肝臟、脾臟、胸腺(臟器行1.6測定抑瘤率及臟器指數(shù))，腫瘤組織凍存于-80℃。

1.6 抑瘤率及臟器指數(shù)測定各組小鼠腫瘤、肝臟、脾臟、胸腺稱重，計算抑瘤率、臟器指數(shù)。

抑瘤率/%=(Control組平均瘤重-處理組平均瘤質(zhì)量)/Control組平均瘤質(zhì)量 × 100%。

臟器指數(shù)/%=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量 × 100%。

1.7 HE染色分析腫瘤形態(tài)學組織切片脫蠟，依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min后自來水沖洗；然后放入蘇木精染液染3～5 min、自來水洗、分化液分化、自來水洗、返藍液返藍、流水沖洗；接著放入85%、95%梯度酒精各脫水5 min，放入伊紅染液中染色5 min；最后放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min后中性樹膠封片。

1.8 乳酸(LD)測試盒檢測小鼠血清中乳酸含量血樣離心(3 000×g，10 min)取上清，按照乳酸(LD)測試盒測定乳酸含量；乳酸(LD)含量=(測定A值-空白A值)/(標準A值-空白A值) × 標準品濃度 × 樣品測試前稀釋濃度。

1.9 乙酰輔酶A檢測試劑盒檢測腫瘤組織內(nèi)乙酰輔酶A的水平取-80 ℃凍存的腫瘤組織約50 mg，冰上充分勻漿，離心(2 000×g，20 min)取上清，按照乙酰輔酶A檢測試劑盒測定乙酰輔酶A含量。

根據(jù)標準曲線計算樣品乙酰輔酶A含量。

1.10 ATP檢測試劑盒檢測腫瘤組織中ATP含量取-80 ℃凍存的腫瘤組織約200 mg，加入2 mL裂解液，冰上充分勻漿，離心(12 000×g，5 min)取上清，按照ATP檢測試劑盒測定ATP含量。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。

相對ATP含量=ATP含量/蛋白濃度。

1.11 Western blot檢測組織中PDH蛋白表達取-80 ℃凍存的腫瘤組織約50 mg，加入RIPA裂解液500 μL，冰上勻漿，4 ℃裂解30 min，離心(12 000×g，10 min)取上清，即為腫瘤組織總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品，100 ℃煮沸5 min變性處理。12.5%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；4 ℃一抗(PDH 1 ∶5 000；β-actin 1 ∶1 000)孵育過夜；室溫鼠二抗(1 ∶1 000)孵育1 h；ECL顯色，化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像拍照，ImageJ軟件用于灰度分析。

1.12 Clark氧電極檢測細胞耗氧量用胰酶消化4T1細胞并計數(shù)，以5×107L-1的密度接種于6孔板中，每孔2 mL。以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50濃度的Andro作用于細胞24 h后，吸掉培養(yǎng)基，收集細胞，用氧電極檢測每組細胞的耗氧率[nmol/(mL·min)]。對每組細胞計數(shù)，根據(jù)耗氧率及細胞數(shù)量計算每組細胞的耗氧率[nmol/(mL·min·104cells)]。

1.13 JC-1染色檢測線粒體膜電位用胰酶消化4T1細胞并計數(shù)，以5×107L-1的密度接種于24孔板中，以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50濃度的Andro作用于細胞24 h后，吸掉培養(yǎng)基，加入JC-1染料(5 mg·L-1)，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育細胞30 min，PBS洗兩次。倒置熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯劑量依賴性抑制4T1細胞的增殖用不同濃度的Andro處理4T1細胞24 h，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，如Fig 1A所示，隨著Andro劑量增加，細胞皺縮變圓，細胞數(shù)量明顯減少；MTT法檢測細胞活性并計算IC50，如Fig 1B所示，Andro可劑量依賴性抑制4T1細胞增殖，其IC50值為40 μmol·L-1。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對4T1荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用將小鼠處死后取瘤觀察，其實體瘤形態(tài)如Fig 2A所示，Andro 5、10 mg·kg-1組瘤體體積與Control組相比均降低，但沒有5-Fu組抑制明顯。各組平均瘤質(zhì)量如Fig 2B所示，Andro 5、10 mg·kg-1組小鼠瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，抑瘤率分別為21.79%、35.89%，而5-Fu作為陽性藥，抑瘤率為57.69%，與Andro給藥組差異存在顯著性。HE染色分析腫瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)，如Fig 2C所示，與Control組相比，Andro 5、10 mg·kg-1組及5-Fu組腫瘤組織細胞呈現(xiàn)不同程度皺縮、數(shù)量減少、間隙增大以及片狀壞死等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對荷瘤小鼠臟器指數(shù)及體重的影響為檢測Andro對小鼠免疫、代謝器官的影響，比較了各組小鼠胸腺、脾臟及肝臟的差異。如Fig 3A、B、C所示，Andro 5、10 mg·kg-1組小鼠胸腺、脾臟、肝臟指數(shù)與Control組相比無差異，5-Fu組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)明顯降低(P均<0.01)。給藥期間荷瘤小鼠的體重變化如Fig 3D所示，Andro 5、10 mg·kg-1組小鼠體質(zhì)量與Control組相比差異均無顯著性，而5-Fu組小鼠體質(zhì)量前6 d增加平緩，從d 7開始出現(xiàn)明顯的差異性，并出現(xiàn)攝食減少、死亡等現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，Andro具有腫瘤抑制作用且毒副作用較小，對正常器官無明顯損傷。

Fig 1 Proliferation of 4T1 cells inhibited by Andro n=3)

Fig 2 The inhibitory effect of Andro on solid tumors in mice n=5)

Fig 3 Effects of Andro on organ index and body weight of mice n=5)

2.4 穿心蓮內(nèi)酯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的可能機制

2.4.1穿心蓮內(nèi)酯對荷瘤小鼠能量代謝方式的影響 將小鼠處死后，收集各組小鼠血清，乳酸檢測試劑盒檢測乳酸含量，如Fig 4A所示，與Control組相比，Andro 5 mg·kg-1組小鼠血清乳酸含量明顯降低(P<0.05)，隨著Andro給藥劑量的增加，血清中乳酸含量由48.5%下降至10.8%，表明Andro可抑制荷瘤小鼠糖酵解水平；同時檢測了有氧呼吸部分指標，如Fig 4B所示，與Control組相比，Andro可劑量依賴性增加腫瘤組織中乙酰輔酶A含量(P<0.05，P<0.01)，如Fig 4C所示，Andro可上調(diào)腫瘤組織中丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)蛋白表達，如Fig 4D所示，Andro可劑量依賴性增加腫瘤組織中ATP含量(P均<0.05)，表明Andro可恢復線粒體氧化磷酸化。以上結(jié)果表明，Andro可抑制荷瘤小鼠糖酵解水平，恢復線粒體氧化磷酸化。

2.4.2穿心蓮內(nèi)酯對4T1細胞線粒體功能的影響 不同濃度的Andro處理4T1細胞24 h，Clark氧電極檢測細胞中線粒體氧消耗，如Fig 5A所示，隨著劑量增加，4T1細胞的耗氧量增加，說明Andro能夠恢復線粒體耗氧，進而恢復線粒體氧化供能。之后，Andro預處理的4T1細胞經(jīng)JC-1染色，熒光倒置顯微鏡觀察細胞紅綠熒光的變化，如Fig 5B所示，隨著Andro濃度的升高，紅色熒光逐漸增強，綠色熒光逐漸減弱，疊加之后熒光顏色由綠色逐漸變?yōu)槌壬砻骶€粒體膜電位升高。Andro作用于4T1細胞使其耗氧量增加、線粒體膜電位升高，表明線粒體功能有所改善。上述結(jié)果說明，Andro的抑瘤作用可能與改善線粒體功能有關(guān)。

3 討論

穿心蓮(andrographis paniculata)是一種在印度、中國和其他東南亞國家/地區(qū)傳統(tǒng)醫(yī)學中被廣泛應用的草藥，其主要用于治療感冒、發(fā)燒、喉炎和多種傳染病。穿心蓮內(nèi)酯作為穿心蓮的主要藥效成分，其抗癌活性受到越來越多的關(guān)注，有研究表明，Andro與卡鉑聯(lián)用可增加Hep-2人喉癌細胞對卡鉑的敏感性[6]，Andro可在體外抑制結(jié)腸癌細胞SW-480、胃癌細胞SGC7901等多種腫瘤細胞增殖[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Andro可在離體水平抑制小鼠乳腺癌細胞4T1細胞增殖，在體水平抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，且對小鼠的生長及免疫器官(胸腺、脾臟)、代謝器官(肝臟)指數(shù)無明顯影響，與陽性藥物5-Fu組小鼠相比，雖然高劑量Andro的抑瘤率降低了22%左右，但未見5-Fu組所出現(xiàn)的毒副作用。

Fig 4 Energy metabolism regulated by Andro in breast cancer n=3)

Fig 5 O2 consumption and membrane potential of mitochondria upregulated by Andro in breast cancer cells n=3)

本研究發(fā)現(xiàn)，Andro可劑量依賴性地下調(diào)乳腺癌荷瘤小鼠血清中乳酸含量，提示，Andro對乳腺癌荷瘤小鼠的抑制作用可能與抑制糖酵解水平有關(guān)。腫瘤的發(fā)生依賴于細胞代謝的重新編程，這是致癌突變的結(jié)果。已知線粒體氧化磷酸化向糖酵解的偏移是大多數(shù)腫瘤具有的能量代謝變化[9]。糖酵解可以為腫瘤細胞提供代謝中間產(chǎn)物，同時產(chǎn)生乳酸，而乳酸的過度累積會加劇腫瘤微環(huán)境的形成，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移[10]。Cai等[11]研究表明，乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A)的敲除可降低乳酸含量，抑制口腔鱗癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，達到降低其惡性程度的目的。另外，糖酵解途徑中其他關(guān)鍵酶，例如丙酮酸激酶同工酶2、己糖激酶2的下調(diào)或敲除，亦可發(fā)揮抗腫瘤作用[12-13]。上述研究表明，糖酵解水平增強是腫瘤細胞的惡性特征之一，抑制糖酵解水平可發(fā)揮抗癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Andro可提高腫瘤組織中ATP含量，同時上調(diào)腫瘤組織中乙酰輔酶A含量、PDH蛋白表達，并可增加4T1細胞線粒體耗氧，表明Andro在抑制糖酵解水平時，對線粒體氧化磷酸化能力有一定的恢復作用，可促進腫瘤細胞氧化供能。同時Andro可升高4T1細胞線粒體膜電位，改善線粒體功能。Kaplon等[14]也提出，可通過調(diào)節(jié)PDH的負調(diào)節(jié)因子丙酮酸脫氫酶激酶1的異位表達或RNAi介導的PDH磷酸酶PDP2的缺失，使PDH活性減弱，誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生。Stepp等[15]提出，敲除N-乙酰轉(zhuǎn)移酶1基因表達可提高乙酰輔酶A水平，抑制乳腺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移侵襲，降低其惡性程度。另一方面，線粒體功能障礙被認為與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，對腫瘤細胞線粒體的狀態(tài)研究表明，腫瘤細胞具有功能性線粒體，并保留進行氧化磷酸化的能力[9]。龐皓玥等[16]提出，川芎嗪聯(lián)合順鉑可減輕線粒體損傷，升高線粒體膜電位，改善線粒體功能，抑制肺癌A549細胞增殖及侵襲。

綜上所述，Andro對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長具有明顯的抑制作用，且對免疫器官及代謝器官無顯著影響。進一步探索其機制發(fā)現(xiàn)，Andro可能是通過抑制糖酵解水平，恢復氧化磷酸化，改善線粒體功能來發(fā)揮其抗癌作用，表明調(diào)整乳腺癌細胞能量代謝途徑可能成為腫瘤治療的新策略。