柚皮苷激活Maxi K對糖尿病心臟的保護作用

肖雯婧，鄧凱文，王婷婷，呼永河，侯 君

(1. 中國人民解放軍西部戰區總醫院藥劑科，四川 成都 610083；2. 西南交通大學醫學院，四川 成都 610031)

柚皮苷(naringin，NA)是一種在柑橘屬水果中大量存在的類黃酮化合物，該化合物對高血壓、冠心病等多種心血管疾病具有良好的保護作用。柚皮苷心血管保護作用機制復雜，涉及多種細胞靶點及相關信號通路。目前，柚皮苷對細胞鉀離子通道的作用機制成為研究其產生心血管保護作用的熱點[1]。

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種由糖尿病引起的心臟疾病，其發病機制與傳統心臟疾病不同，起始于高糖微環境通過多種方式導致的心臟病變，臨床多采用控制血糖減緩DCM發展，目前亟需依據其病理機制開發針對性治療方案[2]。國內外已有多篇報道指出NA對DCM具有保護作用，但其作用機制尚未闡明。研究表明NA可通過激活細胞大電導鈣激活鉀離子通道(The large conductance Ca2+activated K+channels，Maxi K)改善心肌缺血/再灌注損傷以及治療心肌肥厚等疾病[3-4]。Maxi K是一種在多種細胞膜表達的鉀離子通道，具有大電導、對鈣離子濃度及電壓敏感的特點，參與多種病理生理功能[5-6]。Maxi K在心血管疾病中的作用機制被廣泛報道，有學者指出針對Maxi K調節劑的研究是開發心血管疾病防治藥物的有效策略[7]。DCM中已經發現心臟血管平滑肌細胞表面Maxi K表達及功能均明顯下降，Maxi K β亞基缺失可加劇DCM血管纖維化和重構[8-9]，通過逆轉Maxi K在DCM中的變化有望產生良好的治療作用。本研究擬觀察Maxi K特異性抑制劑是否可抵消NA對DCM的保護作用，從而激活Maxi K是否為NA保護DCM的重要環節，為NA作為DCM治療藥物轉化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠(雄性，3月齡)(220-240)g，購于成都達碩實驗動物有限公司，動物準字：SCXK(川)2020-030。動物實驗方案經中國人民解放軍西部戰區總醫院倫理委員會審批通過后進行。飼養過程參照中國動物福利法案，保障動物權益。

1.1.2飼料[10]普通飼料成分(總熱量3.2 kcal·g-1)：脂肪5%、碳水化合物55%、蛋白質23%、其他成分17%(含纖維素及灰分)。高脂飼料(總熱量4.7 kcal·g-1)：脂肪50%、碳水化合物17%、蛋白質25%、其他成分8%(含纖維素及灰分)。

1.1.3試劑 柚皮苷(貨號：C10392280)購于上海麥克林生化公司、鏈脲佐菌素(貨號：s8050)購于北京索萊寶科技有限公司；HE(貨號：C01055)、Masson(貨號：T4104)試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；Maxi Kα(貨號：sc-374142)、Slo-β(貨號：sc-377023)、Collagen Ⅰ(貨號：sc-293182)、Fibronectin(貨號：sc-271098) antibody購于Santa Cruz公司。

1.2 儀器多普勒超聲診斷儀(Sonos 7500，Philips公司)，石蠟切片機(RM2243，Leica公司)，數字凝膠成像系統(Flurochem9900-50qAlphaInnotech公司)，轉移電泳儀(PowerPac Universal 500w，Bio Rad公司)，倒置熒光顯微鏡(13 TS100，Nikon 公司)。

1.3 方法

1.3.1造模及分組 SD大鼠(♂，6周齡)購買后適應性喂養1周，隨機分為4組，每組8只。對照組(CON)給予普通飼料喂養，其余3組大鼠給予高脂飼料喂養。喂養4周后除CON組外，其余模型大鼠按35 mg·kg-1行腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)構建糖尿病心肌病模型(diabetic cardiomyopathy，DCM)。STZ注射1周后，大鼠禁食12 h用尾靜脈血測定血糖值，以空腹血糖≥16.7 mm·L-1為標準確定糖尿病模型造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為3組，分別為模型組(DCM)，柚皮苷組(NA)，柚皮苷+ Maxi K特異性抑制劑組(NA+PAX)，DCM組給予NA組等體積生理鹽水灌胃，1次/日。NA組及NA+PAX組分別給予柚皮苷混懸液40 mg·kg-1[11]或者柚皮苷40 mg·kg-1+paxilline 20 mg·kg-1[12]，1次/日。所有大鼠均連續給藥12周，普通飼料喂養。4組大鼠均每周測定一次體重及空腹血糖。

1.3.2大鼠心功能及血流動力學變化檢測 戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，將其仰臥固定于保溫板并使用直腸探溫針監測動物體溫。大鼠胸部備皮后涂抹耦合劑，多普勒超聲診斷儀檢測大鼠心功能變化程度。選用710超聲探頭(軸向70 μm分辨率)取左心室短軸切面，長軸切面以及心尖四腔心切面行心臟超聲。測量后每組原始數據取連續5個心動周期測量的平均值。超聲檢測指標:左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流(ratio of E/A)、左心室后壁舒張末厚度(LVPWd)、左心室后壁收縮末厚度(LVPWs)、左心室前壁舒張末厚度(LVAWd)、左心室前壁收縮末厚度(LVAWs)。心功能測定后將大鼠頸部正中切口，分離右側頸總動脈，插入塑料導管并固定，導管另一頭經壓力換能器連接生物信號記錄分析系統測定血流動力學變化，檢測指標包括：左室舒張末期壓力LVEDP及左室壓力最大上升和下降速率(dp/dt)。操作均由同一人完成且隨機取樣，未告知動物分組。

1.3.3大鼠心臟病理改變檢測 取大鼠左心室制備為石蠟切片，HE及Masson染色檢測心臟病理改變程度對大鼠主動脈及左心室行Masson染色及HE染色檢測，同時對心肌膠原進行半定量分析計算心肌膠原容積分數(collagen volume fraxtion，CVF)。

1.3.4Western blot檢測心肌相關蛋白表達 取少量大鼠左心室心肌組織，提取總蛋白后測定濃度，每個孔道上樣量約為20 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測心肌Maxi K、Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白水平改變程度。

2 結果

2.1 Maxi K抑制后NA對大鼠體質量及血糖的影響與CON組相比，實驗組大鼠(DCM組，NA組，NA+PAX組)均出現多飲、多食、多尿、體質量減少等糖尿病典型癥狀且血糖明顯增高，但實驗組之間差異無統計學意義(Tab 1)。

2.2 Maxi K抑制后NA對大鼠心功能的影響實驗結果顯示，與文獻結果類似DCM組與CON組相比心臟收縮功能參數LVEF、LVFS、LVPWs無明顯變化[13]，其舒張功能參數E/A、LVAWd、LVPWd和收縮功能參數LVAWs值降低(P<0.05)而LVEDP明顯增加(P<0.05)，血流動力學變化顯示DCM引起dp/dt明顯降低(P<0.05)。NA連續給藥12周后可部分恢復大鼠心功能，其中LVPWd基本可恢復至CON組水平。而使用PAX特異性阻斷Maxi K后，NA心臟保護功能明顯下降，其中E/A、LVPWd與DCM組無差異(Tab 2，Fig 1)。

2.3 Maxi K抑制后NA對大鼠心臟病理學影響HE與Masson染色結果如Fig 2所示，與CON組相比DCM組心臟出現細胞核不規則、纖維腫脹、疏松，空泡樣變性明顯及膠原纖維明顯增多的病理改變。NA組可明顯觀察到肌纖維排列較DCM組略整齊，空泡樣變性及膠原纖維減少。但是，特異性抑制Maxi K后，NA對大鼠心肌病理的改善程度明顯減弱。對Masson染色圖片行CVF分析，與CON組(3.15±0.7)相比，DCM組(40.98±4.7)明顯增加(P<0.05)，與病理結果相似，NA給藥后可降低CVF值(9.03±1.78)，而特異性阻斷Maxi K后，CVF值出現明顯上升(28.19±3.4，P<0.05)。

2.4 Maxi K抑制后大鼠心肌細胞膠原蛋白、纖連蛋白表達水平改變Western blot結果顯示與CON組相比DCM組膠原蛋白及纖連蛋白表達均增強，NA給藥后有所下降。NA+PAX組膠原蛋白及纖連蛋白表達與NA組相比有所增加(Fig 3)。

2.5 NA對DCM大鼠心肌Maxi K表達的作用Fig 4顯示糖尿病可導致大鼠心肌Maxi Kα及β亞基表達量均出現明顯下降。經NA治療后，Maxi K表達未發生明顯恢復。

Tab 1 Changes of body weight and blood glucose in rats

Tab 2 Changes of cardiac function in rats

Fig 1 Representative echocardiographic images of rat heart in each group

Fig 2 HE and Masson staining results and CVF analysis of rat myocardial tissues

Fig 3 Changes in protein levels of myocardial collagenand fibronectin in rats

Fig 4 Changes in myocardial Maxi K α subunitsand β subunits in rats

3 討論

糖尿病患者體內高糖微環境可導致血管功能受損從而繼發DCM，其具體病理機制尚未闡明。部分學者提出假說認為血管內皮細胞膜表面Maxi K功能下降是引起糖尿病患者血管舒張功能受損的重要原因[14]。有學者使用Maxi K通道β亞基敲除小鼠建立糖尿病動物模型，隨后觀察到Maxi K通道功能缺失會促進糖尿病模型動物血管功能障礙、重塑和纖維化程度加重，該實驗結果進一步證明上述假說。后續功能恢復性實驗指出Maxi K特異性開放劑NS1619對動物心臟具有明確保護作用[15]。因此，Maxi K通道有望成為DCM治療干預的重要靶點。

柚皮苷是一類可從飲食攝入的黃酮類化合物，對高血壓、冠心病、糖尿病心肌病等多種心血管疾病產生有利作用。柚皮苷的心血管保護作用涉及多個信號通路和分子靶點，其中柚皮苷對離子通道的調控作用近年來受到了廣泛關注。有報道指出柚皮苷可通過促進Maxi K通道開放對心肌缺血/再灌注產生保護作用，該保護作用可被Maxi K通道特異性抑制劑部分抵消[3]。更為重要的是，有報道指出NA可通過激活Maxi K對1歲齡老年大鼠產生心血管保護作用，該研究結果為老年營養方案設計提供了新視角[16]。

本研究探討柚皮苷對糖尿病模型大鼠心功能的保護作用是否受到Maxi K通道特異性抑制劑PAX的影響。通過建立DCM模型，我們觀察柚皮苷及柚皮苷與PAX聯合給藥后模型大鼠心功能及病理情況改善程度，實驗結果顯示，柚皮苷對DCM具有明確保護作用，可增強模型大鼠心臟舒張功能、降低心肌纖維化程度。但上述保護作用在PAX聯合給藥后明顯下降(P<0.05)。同時，為證明文獻報道所述柚皮苷為Maxi K通道開放劑而非增加其蛋白表達，本研究使用Western blot技術檢測各組模型大鼠心臟Maxi K通道α及β亞基表達程度變化，實驗結果顯示柚皮苷對其無影響。

綜上所述，我們推測促進Maxi K通道功能恢復是柚皮苷對DCM產生保護作用的重要環節。隨著年齡增加，細胞離子通道功能進一步衰退[17]，NA通過調控Maxi K在老年大鼠心功能保護中展現的優良作用[16]提示我們，與傳統DCM候選藥物相比，NA通過恢復Maxi K功能可能對老年糖尿病患者心功能具有更好的保護作用。該實驗依據可用于指導設計老年糖尿病患者膳食營養方案，以延緩其心功能障礙提高患者生活質量。