黃芩苷增強SD大鼠腦中動脈平滑肌細胞BK通道介導的外向電流

王 盛，蔣蕾蕾，魏 雯，王家寧，張傳林2,

(1. 石河子大學醫學院第一附屬藥劑科，新疆 石河子 832000; 2. 石河子大學醫學院生理教研室/新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002; 3. 十堰市人民醫院(湖北醫藥學院附屬人民醫院)心功能科，湖北 十堰市 442000)

黃芩苷(Baicalin)提純于黃芩，在臨床有著廣泛的應用[1-3]。大電導鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channels，BK)廣泛分布于血管平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)，具有調節血管張力作用。BK激活后引起平滑肌超極化，動脈血管擴張[4-5]。我們利用黃芩苷，聯合應用壓力型小動脈測量儀和膜片鉗技術，觀察黃芩苷對SD大鼠腦中動脈血管及其SMC BK通道的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物黃芩苷使用預先配置的細胞外液溶解，通過開關控制藥物灌流標本，保持灌流速度、溫度和其他成分不變。

1.2 實驗動物實驗室所用SD大鼠由北京維通利華公司(許可證編號SCXK京2016-0006)提供，動物質量符合一級標準，雌雄不拘，重約250 g。

1.3 試劑黃芩苷(貨號572667)、去甲腎上腺素(貨號Y0000683) (norepinephrine，NA)和ibTX(貨號I5904)購自Sigma公司，其余試劑為國產分析純試劑。

1.4 儀器Digidata 1440A數模轉換器和AXON multicalmp 700B膜片鉗放大器購自美國Axon公司。P-97 拉制儀購自美國Sutter公司。壓力型小動脈測量儀(DMT)購自丹麥Denmark公司。

1.5 實驗方法

1.5.1壓力型小動脈測量儀技術 參照Li等[6]和何瓊等[7]實驗方法：快速分離的SD大鼠腦中動脈被固定在水域中，兩端由玻璃微電極固定，設備自動測量血管直徑的變化。

1.5.2膜片鉗技術

1.5.2.1 全細胞膜片鉗技術 參照張傳林等[8]實驗方法：急性消化分離的腦中動脈SMC至于培養皿中，在高阻封接后給予短暫的脈沖負壓打破細胞膜，形成全細胞封接，統計分析刺激電壓為60 mV的外向電流。

1.5.2.2 內面朝外式膜片鉗技術 參照文靜等[9]實驗方法：單個IRSMCs至于玻璃培養皿中，培養皿中含有溶液(單位：mmol·L-1)：KCl 140，MgCl21.0，HEPES 10，EGTA 0.1，pH7.4。玻璃微電極電阻為5～10 Ω，溶液含有(mmol·L-1)：KCl 140、CaCl21.0、MgCl21.0、HEPES 10、EGTA 0.1，pH7.4。通過微正壓使細胞膜與玻璃微電極形成GΩ封接，通過微操縱器提起電極尖端，待尖端膜片完全分離后記錄單通道電流。

Tab 1 Baicalin relaxed middle cerebral artery(n=10 vessel segments, *P<0.05 vs control)

2 結果

2.1 黃芩苷呈濃度依賴性舒張SD大鼠腦中動脈在含有NA(10-6mol·L-1)的PSS液體水浴槽(37 ℃)中固定好的血管段孵育10 min，測量血管直徑，再依次給予10-6、10-5、10-4、10-3、10-2mol·L-1的黃芩苷孵育10 min，血管直徑明顯增加。EC50是1.8×10-5mol·L-1(n=10，P<0.05)。見Tab 1。

2.1.1BK通道阻斷劑ibTX對黃芩苷的舒張作用的影響 血管段在含NA(10-6mol·L-1)的PSS液體中孵育10 min，測量血管直徑(Control)是(249.8±10.9)μm。給予含有黃芩苷(1.8×10-5mol·L-1)和NA(10-6μmol·L-1)的PSS液體孵育10 min后，血管段直徑是(290.6±10.4)μm(n=10,P<0.05)，給予BK通道阻斷劑ibTX孵育10 min，血管段直徑是(202.1± 9.1)μm，細胞外液洗脫10 min后，血管段直徑是(240.3± 9.7)μm，較Control差異無統計學意義(n=10,P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 IbTX blocked baicalin-mediated relaxation

2.1.2黃芩苷對腦中動脈SMC外向電流的影響 依次給予10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol·L-1黃芩苷，SMC外向電流分別增加(101.4±4.1)%、(109.0±3.8)%、(117.4±4.2)%, (129.3±3.1)%、(138.6±3.2)%、(143.2±3.7)和(141.7±3.5)%，提示黃芩苷增加腦中動脈SMC外向電流呈濃度依賴性。EC50是2.1×10-6mol·L-1(n=10，P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Baicalin increased outward current(60 mV) of middle cerebral artery smooth muscle cells in a concentration dependent manner(n=10 cells, *P<0.05 vs control)

2.1.3BK通道阻斷劑ibTX對黃芩苷介導的外向電流的作用 預灌流黃芩苷(2.1×10-6mol·L-1)后，記錄到外向電流較Control增加(121.4±8.2)%，預灌流BK通道阻斷劑ibTX(10-7mol·L-1)3 min，記錄到外向電流較Control降低(74.0±8.0)%，預灌流BK通道阻斷劑ibTX(10-7mol·L-1)和黃芩苷(2.1×10-6mol·L-1)混合液3 min，記錄到外向電流較Control降低(78.0±9.8)%，洗脫3 min后，記錄到外向電流較Control差異無統計學意義(n=10，P<0.05)。見Fig 3。

2.2 黃芩苷對腦中動脈SMC BK通道開放頻率的影響快速分離的SMC被孵育在預先配置的液體中，記錄的BK通道的開放頻率(Control)，預灌流黃芩苷(2.1×10-6mol·L-1)15 s,，BK通道的開放頻率較Control明顯增加，預灌流BK通道阻斷劑ibTX(10-7mol·L-1) 和黃芩苷(2.1×10-6mol·L-1) 3 min后，BK通道的開放頻率明顯減少，洗脫后BK通道的開放頻率較Control差異無統計學意義(n=10，P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Baicalin increased BK channel open probabilities(n=10 cells, *P<0.05 vs control)

Fig 3 Baicalin increased BK channel-mediated outward currents(60 mV)

3 討論

黃芩苷屬于黃酮類物質[10]，在臨床有著廣泛應用。本研究結果顯示：黃芩苷對SD大鼠腦中動脈血管段具有明顯的舒張作用，BK通道阻斷劑ibTX阻斷黃芩苷的舒張作用，BK通道阻斷劑ibTX明顯降低黃芩苷增加的BK通道開放頻率，提示黃芩苷舒張血管，降低血壓是通過介導BK通道實現的。

黃芩苷呈濃度依賴性增強SD大鼠腦中動脈SMC介導的外向電流；BK通道阻斷劑ibTX阻斷黃芩苷介導的腦中動脈SMC外向電流，這提示黃芩苷激活BK通道，引起血管SMC復極化是其舒張血管的機制。也有研究發現，黃芩苷還有其他的舒張血管的作用機制：卞筱泓等[11]研究發現黃芩苷對大鼠胸主動脈的舒張作用，這種舒張作用與KATP通道及鈣離子通道有關[12]；文敏[13]發現黃芩苷舒張家兔和豚鼠腸管平滑肌，這種舒張作用與鈣離子[14]有關；嚴國森[15]發現黃芩苷通過MAPK/ERK信號通路調節肺動脈高壓血管重構過程；這都證實了黃芩苷舒張血管的多種機制。

綜上所述，黃芩苷不僅通過增加BK通道開放頻率，增強BK通道介導的外向電流，舒張SD大鼠腦中動脈血管，降低自發性高血壓大鼠收縮壓，也通過多種途徑發揮降血壓作用。