特定藥物激活受體介導PVN谷氨酸能神經元抑制對小鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響

陳振星，何淑芳，許士進，王 斌，張 野

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科，麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室，安徽 合肥 230601)

缺血性心臟病是臨床上常見的致死疾病，早期對缺血的心肌組織采用各種方式恢復血供是改善臨床預后的最有效方式[1]，但是心肌缺血/再灌注損傷降低了血供恢復帶來的益處。研究表明，心肌缺血/再灌注損傷可能涉及中樞神經系統的調控[2-3]。下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus，PVN)位于下丘腦內側區，能夠直接通過神經元調節交感神經緊張性，而心肌缺血/再灌注損傷則是由于交感神經系統的異常激活所致[3- 4]。谷氨酸能神經元是PVN腦區內主要的興奮性神經元，與交感神經活性密切相關[5-6]，然而PVN核團是否通過調控谷氨酸能神經元的興奮性參與心肌缺血/再灌注損傷目前尚不清楚。

化學遺傳是利用遺傳學原理，通過生物活性小分子與蛋白相互作用來研究生物學系統功能的一種方法[7]，具有高效、可逆、特異性地干擾靶蛋白或靶細胞的功能。化學遺傳的核心為特定藥物激活的受體(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs),DREADD被一種特殊的藥物氯氮平-N-氧化物(clozapine N-oxide，CNO)激活后可以選擇性地作用于不同的G蛋白(Gi/Gq)受體，最終實現神經元的抑制或者激活效應。hM4Di在抑制性DREADD中應用最為廣泛，在中樞可與納摩爾級別的CNO結合，并被激活實現神經元的抑制效應[8]。CAMKⅡα為谷氨酸能神經元特異性啟動子，可實現病毒對谷氨酸能神經元的特異性感染[9-12]。本研究將探討通過化學遺傳技術調控PVN腦區谷氨酸能神經元興奮性對小鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇SPF級雄性C57BL6小鼠，8-10周齡，體質量(20～25) g，購買于安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(皖)2017-006。小鼠分籠飼養，可自由飲水及攝食，飼養環境溫度保持在(21～25) ℃。

1.2 藥物與試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)(批號：BCCC7515，Sigma公司，美國)，腺病毒(AAV)載體：rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpA(批號：9-524-K200629，武漢樞密腦科學有限公司)和rAAV-CaMKⅡα-EGFP-WPRE-hGHpA病毒載體(批號：9-290-K200917，武漢樞密腦科學有限公司)，ELISA檢測試劑盒(批號：BJ11112020，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)。Cleaved caspase-3 Antibody(批號：22，Cell Signaling Technology，美國)，ERK(批號：20，Cell Signaling Technology，美國)，pERK(批號：24，Cell Signaling Technology，美國)。

1.3 實驗設備PowerLab動物實驗數據采集系統(AD公司，澳大利亞)，小動物呼吸機(成都泰盟軟件有限公司)，腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，微型手持顱骨鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，微量輸注泵(KDS)，顯微鏡(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，動物保溫系統(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.4 PVN置管模型小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，麻醉起效后置于37 ℃保溫毯，固定于腦立體定位儀，手術區域皮膚消毒，暴露顱骨，確定前囟。根據George Paxinos小鼠腦立體定位圖譜(第二版)，定位雙側PVN坐標(前囟后0.7 mm，中線左右旁開0.13 mm，深度4.75 mm)。顱骨鉆孔，置入導管(導管帶有基座)，并插入內芯，牙科粉固定于顱骨表面，涂抹青霉素軟膏后縫合皮膚，皮膚表面再次涂抹青霉素軟膏。置管后小鼠單籠飼養3 d，術后出現感覺或運動功能障礙的小鼠棄用。

1.5 心肌缺血/再灌注損傷模型腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，固定于37 ℃保溫板上，氣管插管后連接小動物呼吸機，設置呼吸頻率(100～120)次/min，潮氣量(0.5～1.2) mL。連接PowerLab Systems，監測心電圖(ECG)。沿左鎖骨中線切開皮膚約1～2 cm，左4～5肋間處進入胸腔，謹慎分離胸腺，剪開心包膜，于肺動脈圓錐與左心耳之間采用8-0 Prolene線穿線，穩定15 min后，心臟表面置一4-0棉線，采用方結結扎左前降支(LAD)，并作一活結，拉緊線結，即造成LAD閉塞致心肌缺血，并可見LAD支配區域心肌發紺，同時ECG出現明顯的ST段弓背抬高。缺血60 min后松開線結，輕提棉線，方結即松開，則開始再灌注。

1.6 實驗分組取PVN置管成功的24只小鼠，隨機數字表法分為4組(n=6)：假手術組(Sham組)，心肌缺血/再灌注組(IR組)，腺病毒對照組(AAV-con + IR組), 谷氨酸能神經元抑制病毒組(AAV-M4 + IR組)。Sham組、IR組通過導管PVN雙側微量注射0.9%生理鹽水，每側100 nL。AAV-con + IR組通過導管PVN雙側微量注射帶綠色熒光基團的空病毒載體rAAV-CaMKⅡα-EGFP-WPRE-hGHpA，每側100 nL，AAV-M4 + IR組通過導管PVN雙側微量注射化學遺傳抑制病毒rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpA,同樣每側100 nL。4組小鼠單籠飼養3周后， Sham組和IR組術前1 h腹腔注射生理鹽水(2 mg·kg-1)，AAV-con + IR組、AAV-M4 + IR組術前1 h腹腔注射CNO(2 mg·kg-1)，CNO腹腔注射后在體內大約經過60-120 min起效，并且具有長時程穩定的效應[13]。隨后AAV-con + IR組、IR組、AAV-M4 + IR組缺血1 h，再灌注2 h，Sham組開胸后穿線不結扎。

1.7 病毒感染效率及注射位置小鼠注射病毒后3周，取大腦，4%多聚甲醛固定24 h，10%～30%蔗糖階梯沉糖后以40 μm厚度冰凍切片，PBS清洗5次，每次8 min。0.3%PBST通透15 min，CAMKⅡα(1 ∶500)一抗孵育4 ℃過夜，PBS清洗5次，每次8 min，二抗采用山羊抗兔IgG(H+L)抗體(1 ∶1 000)，孵育2 h，PBS清洗5次，每次8 min，封片液封片，熒光顯微鏡下觀察谷氨酸能神經元熒光，并與病毒熒光雙標，驗證病毒感染效率。

實驗結束后，小鼠取大腦，4%多聚甲醛固定24 h，10%～30%蔗糖階梯沉糖后以40 μm厚度冰凍切片，熒光顯微鏡觀察病毒熒光，驗證注射位置是否準確，將病毒注射位置不準確小鼠排除，并采用隨機數字表法重新補足至每組6只。

1.8 PVN內c-fos免疫熒光實驗結束后，小鼠取大腦，4%多聚甲醛固定24 h，10%-30%蔗糖階梯沉糖后以40 μm厚度冰凍切片，PBS清洗5次，每次8 min。0.3%PBST通透15 min，c-fos(1 ∶1 000)一抗孵育4 ℃過夜，PBS清洗5次，每次8 min，二抗采用山羊抗兔IgG(H+L)抗體(1 ∶1 000)，孵育2 h，PBS清洗5次，每次8 min，封片液封片，熒光顯微鏡下觀察,ImageJ軟件分析免疫熒光強度[14]。

1.9 心電圖記錄觀察小鼠缺血前、缺血后及再灌注后心電圖變化。記錄心肌缺血前5 min(T0)、心肌缺血即刻(T1)、心肌缺血60 min(T2)、再灌注120 min(T3)時的心率。

1.10 心肌梗死面積測定再灌注結束后處死小鼠，取出心臟，PBS灌注，沖洗出血液，重新結扎LAD。在顯微鏡下主動脈置管，從主動脈逆行灌注1%伊文氏藍溶液0.2 mL左右，置于-80 ℃冰箱速凍1 h。將心臟置于小鼠心臟模具中，自心尖至LAD結扎處將心臟平切為厚度1 mm的薄片3～4片，置于1% TTC溶液中，37 ℃(pH7.4)孵育10 min放入4%多聚甲醛中浸泡固定12 h。Image J軟件計算右心室面積(RV)、左心室面積(LV)、梗死區面積(IS)與缺血危險區面積(AAR)之比、危險區面積與心室總面積(RV + LV)之比。

1.11 血清cTnI濃度測定再灌注結束時從左心室抽取血樣0.5 mL，置于離心機中13 200 r·min-1轉速離心15 min，取上清液置于-80 ℃保存，ELISA法測定血清cTnI濃度。

1.12 Western blot再灌注結束后處死小鼠，提取小鼠左心室組織，預冷PBS沖洗，勻漿前先稱重。將小鼠左心室組織剪碎，碾磨至粉狀，置于勻漿器中，冰上裂解，勻漿器中加入RIPA裂解液。裂解至澄清后將勻漿液以3 500 r·min-1的速度離心5 min，取上清液置于-20 ℃保存備用。BCA蛋白定量試劑盒測定570 nm處OD值進行蛋白定量。取適量上清液按1 ∶4加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。待冷卻后對蛋白質進行12% SDS-PAGE凝膠電泳濃縮膠70 V, 30 min，分離膠110 V, 60 min。隨后轉移至PVDF膜上200 mA恒流, 50 min。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。加入GAPDH(1 ∶1 000)、cleaved caspase(1 ∶1 000)、pERK(1 ∶2 000)、ERK(1 ∶2 000)一抗4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，二抗采用山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)或山羊抗鼠IgG(1 ∶1 000)室溫孵育90 min，TBST洗滌4次，每次5 min，采用化學發光法ECL顯影，凝膠成像系統拍照，Image J軟件計算蛋白條帶灰度值。

1.13 統計學處理采用Prism 5.0軟件進行統計學分析，正態分布的計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，重復測量設計資料采用重復測量設計的方差分析。

2 結果

2.1 病毒轉染效率及注射位置熒光顯微鏡下觀察小鼠腦片PVN病毒熒光，對照腦圖譜證實病毒注射位置準確；觀察PVN病毒熒光與谷氨酸能神經元免疫熒光共標，確定病毒成功轉染谷氨酸能神經元，圖Fig 1。

2.2 PVN內c-fos免疫熒光表達與Sham組相比，各組PVN內c-fos表達升高(P<0.05)，與IR組及AAV-con + IR組相比，谷氨酸能神經元抑制病毒組c-fos表達降低(P<0.05)，見Fig 2,表明CNO成功激活hM4D(Gi)并誘導谷氨酸能神經元興奮性降低。

Fig 1 rAAV-CamKIIα-EGFP-expressing PVN neurons

Fig 2 C-fos expression in each n=6)

2.3 心電圖與Sham組相比，IR組及AAV-con+IR組T1時HR升高，T2-3時HR降低(P<0.05)；與IR組及AAV-con+IR組相比，谷氨酸能神經元抑制病毒組T1-2時HR降低(P<0.05)，T3時HR無差異(P>0.05)，見Fig 3。

Fig 3 Heart rate of different time points

2.4 心肌梗死面積與Sham組相比，各組IS體積、IS/AAR增大(P<0.05，Fig 4)，與AAV-con+IR組及IR組相比，谷氨酸能神經元抑制病毒組IS面積、IS/AAR減小(P<0.05，Fig 4)，IR組與AAV-con+IR組相比，IS體積、IS/AAR之比均無差異(P>0.05，Fig 4)，表明抑制谷氨酸能神經元興奮性能明顯減少心肌缺血/再灌注小鼠心肌梗死面積。

2.5 血清cTnI濃度與Sham組相比,各組cTnI濃度升高(P<0.05)，與AAV-con+IR組及IR組相比，谷氨酸能神經元抑制病毒組cTnI濃度降低(P<0.05)，IR組與AAV-con+IR組比較，各時段cTnI濃度均無明顯差異(P>0.05)，見Fig 5，表明抑制谷氨酸能神經元興奮性明顯減輕小鼠心肌損傷。

2.6 pERK、ERK、cleaved caspase-3蛋白表達與Sham組相比，各組pERK表達降低(P<0.05)，與IR組及AAV-con+IR組相比，AAV-M4+IR組即谷氨酸能神經元抑制病毒組pERK表達明顯增加(P<0.05)，且心肌凋亡蛋白cleaved caspase-3表達降低(P<0.05)，見Fig 6，表明抑制谷氨酸能神經元興奮性可通過ERK通路降低心肌缺血/再灌注小鼠心肌凋亡蛋白的表達。

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷極大的降低了血管再通帶來的益處，影響患者的預后和生活質量。心肌缺血/再灌注損傷的外周機制研究目前已較為成熟，但中樞機制特別是涉及PVN的調控目前尚不清楚。PVN位于下丘腦內側區，參與調節及整合機體諸多生理功能，并在調節血壓、心衰等心血管相關疾病中發揮不可忽視的重要作用[4]，因此，探索心肌缺血/再灌注損傷中PVN的作用對于進一步明確心肌缺血/再灌注損傷的中樞調控機制顯得十分必要。

Fig 4 Myocardial infarct size n=6)

Fig 5 Serum troponin concentration

Fig 6 Protein expression of cleaved caspase-3

本研究中，結扎小鼠LAD后ST段明顯抬高且心尖部發紺證明IR造模成功，熒光顯微鏡下觀察小鼠腦片PVN內病毒綠色熒光，證明PVN置管模型成功。為了研究PVN谷氨酸能神經元興奮性對心肌缺血/再灌注損傷的影響，病毒載體攜帶了谷氨酸能神經元特異性啟動子CaMKⅡα，病毒熒光與谷氨酸能神經元特異性啟動子CaMKⅡα免疫熒光共標確認病毒成功轉染谷氨酸能神經元。AAV-M4 + IR組病毒載體攜帶了hM4D(Gi)插件，與CNO結合后，誘導谷氨酸能神經元興奮性降低，未攜帶hM4D(Gi)插件的AAV-con + IR組谷氨酸能神經元興奮性則不受影響。AAV-M4 + IR組即谷氨酸能神經元抑制病毒組PVN內c-fos免疫熒光表達較AAV-con + IR組明顯減少證實CNO起效，化學遺傳成功發揮作用。

如前所述，交感神經的異常激活導致心肌缺血/再灌注損傷，而交感神經興奮性降低則減少兒茶酚胺釋放，減少心肌耗氧量，降低心肌做功，同時降低心肌細胞各種促炎因子表達，最終減輕心肌缺血/再灌注損傷[15]。本實驗中觀察到，AAV-M4 + IR組即谷氨酸能神經元抑制病毒組小鼠心肌梗死面積減少，PVN中c-fos表達減少，心肌損傷標志物肌鈣蛋白cTnI降低，心肌凋亡蛋白cleaved caspase-3也降低，表明PVN注射rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpA后通過CaMKⅡα啟動子轉染谷氨酸能神經元，術前腹腔注射CNO激活hM4D(Gi)誘導核團內谷氨酸能神經元興奮性降低，繼而導致交感神經興奮性下降[5]，減弱交感神經的異常激活，最終改善小鼠心肌缺血/再灌注損傷。同時，實驗中觀察到，與IR組及AAV-con + IR組相比，Western blot檢測到谷氨酸能神經元抑制病毒組pERK蛋白表達升高，ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要亞族，參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等等，ERK蛋白已被證實在多種物質或藥物減輕心肌缺血/再灌注損傷的調控中發揮作用[16-17]，推測PVN通過核團內谷氨酸能神經元減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷的機制可能與上調ERK蛋白相關，但進一步的上下游通路機制尚需更深入的研究。

綜上所述，通過腺相關病毒載體特異性感染下丘腦室旁核谷氨酸能神經元，同時利用化學遺傳DREADD術介導使谷氨酸能神經元興奮性下降可減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷。