IL-36Ra抑制炎性痛小鼠脊髓A1型星形膠質細胞極化

李 倩，朱怡文，李玲玲

(1. 上海市兒童醫院，上海交通大學附屬兒童醫院，中心實驗室，上海 200040； 2.上海交通大學醫學遺傳研究所，上海 200040； 3. 國家衛健委醫學胚胎分子生物學重點實驗室，上海市胚胎與生殖工程重點實驗室，上海 200040

慢性炎性痛是一種嚴重破壞患者生活質量的常見疾病。盡管目前對炎性痛的分子機制尚未完全闡明，但脊髓中的促炎性細胞因子是公認的關鍵病理因素。IL-1β和IL-33等白介素(IL)-1超家族細胞因子可通過作用于其特異性受體參與炎性痛的發生發展[1]。

IL-36α(以前稱為IL-1F6)、IL-36β(IL-1F8)和IL-36γ(IL-1F9)是最近報道的IL-1細胞因子家族新成員。IL-36細胞因子的每個成員都可通過結合IL-36受體(IL-36R)及IL-1R輔助蛋白(IL-1RAcP)激活下游絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)和核轉錄因子(nuclear factor kappa B，NF-κB)等信號通路促進炎癥反應[2]。而IL-36R拮抗劑(IL-36 receptor antagonist，IL-36Ra)可競爭性結合IL-36R，阻斷IL-36R及其下游信號通路[3]。已證實，IL-36及其受體參與多種炎性疾病的病理過程。我們之前研究也表明，CFA炎性痛小鼠脊髓IL-36γ與IL-36R表達升高，而給予IL-36Ra可緩解小鼠痛行為[4]。但IL-36Ra緩解炎性痛的具體作用機制目前尚不清楚。

IL-36R在小鼠脊髓內主要表達于星形膠質細胞，星形膠質細胞作為中樞神經系統內數量最多的一類細胞，在炎性痛調控中至關重要。在外周炎性刺激時，脊髓星形膠質細胞可被激活，形態上增生、肥大，稱為反應性星形膠質細胞。反應性星形膠質細胞釋放的促炎、趨化因子可直接作用于神經元，導致中樞敏化，促進炎性痛維持與發展[5]。最新研究表明，星形膠質細胞激活后可向A1和A2兩種不同的表型極化，A1型星形膠質細胞可分泌促炎性細胞因子，加劇神經炎癥反應；A2型星形膠質細胞可分泌神經營養因子，具有神經保護性[6]。本研究旨在研究IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠痛行為以及脊髓A1型星形膠質細胞極化的作用。揭示其緩解炎性痛的分子作用機制，為臨床治療炎性痛提供可能靶點。

1 材料

1.1 動物成年♂ C57BL/6小鼠53只，6-8周齡，體質量(25～30)g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(滬)2018-0003。飼養環境為12 h光照/黑夜循環，溫度(22-25)℃。

1.2 試劑CFA試劑購自Sigma公司(F5881-10 mL)；IL-36Ra純化蛋白購自R&D公司(2714-ML-025/CF)；GFAP抗體購自Millipore公司(MAB360)、C3抗體購自Abcam公司(ab200999)；FITC或Cy3標記的熒光二抗購自Jackson公司；RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；逆轉錄試劑盒購于Takara公司，SYBR Green試劑購于Roche公司。

2 方法

2.1 動物分組與處理行為學實驗將32只小鼠隨機分為4組，每組8只：對照治療組(CFA + Saline組)、IL-36Ra不同劑量治療組：CFA+IL-36Ra 50 ng、CFA+IL-36Ra 100 ng、CFA+IL-36Ra 200 ng。每組均在造模后d 1至d 7鞘內注射給藥，每日1次。造模后d 1、3、5、7檢測各組小鼠痛行為變化。

分子實驗將12只小鼠隨機分為4組，每組3只：正常組、對照治療組(CFA + Saline組)、CFA+IL-36Ra 100 ng組、CFA+IL-36Ra 200 ng組。造模及給藥方法同行為學實驗，給藥7 d后新鮮取材脊髓組織用于RT-PCR實驗。

形態學實驗將9只小鼠隨機分為3組，每組3只：正常組、對照治療組(CFA + Saline組)、CFA+IL-36Ra 200 ng組。造模及給藥方法同行為學實驗，給藥7 d后灌流固定取材脊髓組織用于免疫熒光實驗。

2.2 動物模型建立外周炎性痛小鼠模型制備：固定小鼠，抓取小鼠右后爪，使用微量注射器向小鼠足底正中表面注射20 μL完全弗氏佐劑。

2.3 機械刺激縮足閾值分別在造模前以及造模后d 1、3、5、7檢測各組小鼠的機械刺激縮足閾值 (mechanical withdraw threshold, MWT)。方法如下：將小鼠置于鋪有小孔鐵絲網的籠中適應至少30 min。然后使用一組von Frey弗萊毛(0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0和1.4 g)垂直刺激右側后爪的掌面正中。采用Dixon介紹的Up and down方法測得小鼠的50% MWT[7]。

2.4 輻射熱刺激縮爪潛伏期分別在造模前以及造模后d 1、3、5、7檢測各組小鼠的輻射熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)。具體方法：將小鼠放置在底部鋪有玻璃板的亞克力籠中，將輻射熱施加到右側后爪足底表面，直到小鼠將其爪子從玻璃板上抬起。縮爪潛伏期為從輻射熱開始到小鼠縮爪的時間，截止時間設為20 s[7]。

2.5 用免疫熒光法測定脊髓GFAP、C3表達正常、CFA+Saline以及CFA+IL-36Ra 200 ng小鼠在給藥7 d后取材，每組3只。具體方法：采用1%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后灌流多聚甲醛固定取材，取腰膨大段脊髓組織，經蔗糖梯度脫水OCT包埋后冰凍切片。采用小鼠來源GFAP以及兔來源C3一抗進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡拍照采集結果。

2.6 用RT-PCR法檢測星形膠質細胞標志物表達正常、CFA+Saline以及CFA+IL-36Ra 100和200 ng小鼠在給藥7 d后新鮮取材，每組3只。具體方法：采用1%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，生理鹽水灌注后新鮮取材腰膨大段脊髓組織。提取脊髓組織的RNA，將RNA逆轉錄成cDNA，使用SYBR Green試劑進行實時熒光定量PCR反應。結果以2-△△Ct計算靶基因的轉錄水平。

3 結果

3.1 IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠MWT和PWL作用使用雄性C57BL/6小鼠成功建立CFA炎性痛小鼠模型。與造模前相比，各組小鼠在造模后d 1即出現MWT明顯下降。而IL-36Ra 100、200 ng在連續給藥5 d后可有效提高CFA小鼠造模側機械痛閾，且較生理鹽水對照組差異有顯著性(P<0.05)。IL-36Ra 200 ng在治療7 d后，可使CFA小鼠MWT恢復至造模前71.9%，明顯緩解炎性痛小鼠機械性痛覺超敏(Fig 1A)。

CFA小鼠造模后各組PWL明顯下降，出現明顯熱痛覺過敏。而IL-36Ra 100、200 ng連續給藥3 d后，均可以明顯提高CFA小鼠PWL(P<0.05)。IL-36Ra 100、200 ng在治療7 d后，可使CFA小鼠PWL分別提高50.0%與66.2%(Fig 1B)。

Fig 1 Effects of IL-36Ra on ipsilateral MWT and PWL of CFA mice n=8)

3.2 IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠脊髓反應性星形膠質細胞作用為了進一步探索IL-36Ra緩解炎性痛的作用機制，選取IL-36Ra有效劑量100 ng和200 ng觀察其對脊髓反應性星形膠質細胞的作用。RT-PCR實驗發現，CFA小鼠脊髓內星形膠質細胞激活標志物GFAP、Lcn2的mRNA表達水平較正常小鼠明顯升高(P<0.05)。與生理鹽水相比，IL-36Ra 100 ng與200 ng連續治療7 d后均可明顯抑制CFA誘導的GFAP mRNA水平升高。同時，IL-36Ra 200 ng可顯著抑制Lcn2 mRNA水平升高(P<0.05)(Fig 2)。表明IL-36Ra可抑制CFA引起的小鼠脊髓星形膠質細胞激活。

Fig 2 Effects of IL-36Ra on mRNA expression changes of GFAP, Lcn2 in spinal cord of CFA mice n=3)

3.3 IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠脊髓A1、A2型星形膠質細胞標志物表達的作用RT-PCR實驗發現，在CFA小鼠上，IL-36Ra 200 ng連續治療7 d可逆轉CFA誘導的脊髓A1型星形膠質細胞標志物Serping1、H2-T23表達升高，且較生理鹽水治療組差異有顯著性(P<0.05)，見Fig 3A-B。CFA小鼠造模后脊髓A2型星形膠質細胞標志物S100a10、Ptx3的mRNA表達水平下降，但IL-36Ra治療對其無明顯影響(P>0.05)，見Fig 3C-D。提示IL-36Ra可抑制CFA小鼠脊髓星形膠質細胞向A1型極化。

3.4 IL-36Ra對CFA小鼠脊髓A1型星形膠質細胞標志物C3表達影響為了進一步從形態上觀察IL-36Ra對CFA小鼠脊髓星形膠質細胞激活以及向A1表型極化的作用，采用正常組、CFA+生理鹽水組以及IL-36Ra有效劑量200 ng組進行形態學實驗。免疫熒光實驗發現，CFA+生理鹽水組小鼠在造模后d 7，造模側脊髓背角內A1型星形膠質細胞標志物C3與GFAP的信號均顯著增多，星形膠質細胞增生、肥大(Fig 4)。而IL-36Ra 200 ng可抑制CFA小鼠脊髓中C3與GFAP信號升高。統計相對熒光強度發現，IL-36Ra治療可以顯著抑制CFA小鼠脊髓背角A1型星形膠質細胞標志物C3與GFAP的共定位信號水平(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Effects of IL-36Ra on mRNA expression changes of A1 and A2 astrocyte maker in spinal cord of CFA mice n=3)

Fig 4 Effects of IL-36Ra on GFAP (green) and C3 (red) immunoreactivity in ipsilateral spinal cord dorsal horn of CFA mice (×200,n=3)

Fig 5 Statistical results of GFAP (green) and C3 (red) immunoreactivity in ipsilateral spinal cord dorsal horn of CFA mice n=3)

4 討論

外周炎性痛是臨床上最常見的癥狀之一，常伴發于局部感染以及關節肌肉炎癥等病理過程。中樞敏化是炎性痛發生的重要病理機制。脊髓作為處理疼痛信息的低級中樞，外周神經傳入的傷害性信息會在脊髓進行加工整合，繼而上行投射到腦干與大腦皮層產生痛覺[8]。而由膠質細胞激活、促炎性細胞因子大量生成為特征的神經炎癥可降低脊髓神經元興奮性閾值，在炎性痛的發生發展中起了非常重要的作用[9]。本研究通過CFA進行炎性痛造模，小鼠造模后表現有穩定的痛行為，且脊髓內存在星形膠質細胞激活，說明存在神經炎癥反應，進一步證實模型建立成功。

IL-36α、IL-36β和IL-36γ是IL-1細胞因子超家族的新成員，而在小鼠脊髓中僅可檢測到IL-36γ表達。IL-36γ表達于脊髓神經元，而其受體IL-36R則主要表達于星形膠質細胞。IL-36γ/IL-36R作為一條新發現的神經元—星形膠質細胞間信號通路，可通過誘導星形膠質細胞激活促進神經炎癥[4]。在本研究中，IL-36R拮抗劑IL-36Ra連續鞘內給藥可顯著緩解CFA小鼠機械性痛覺超敏與熱痛覺過敏，證實IL-36R及其下游信號通路參與炎性痛過程。此外，IL-36Ra還有效抑制了脊髓星形膠質細胞激活，進一步證實阻斷IL-36R可直接調節脊髓星形膠質細胞活性。

在神經炎癥過程中，激活后的星形膠質細胞可向A1表型極化。有研究證實，A1型星形膠質細胞內C3等補體蛋白過度表達，生成大量SERPINA3、CXCL10等趨化因子、促炎因子[10]。而抑制脊髓星形膠質細胞向A1型極化可有效緩解慢性痛痛行為[11]。本研究發現CFA小鼠脊髓內A1型星形膠質細胞標志物表達升高，而IL-36Ra 200 ng治療7 d后，A1型星形膠質細胞標志物明顯降低。同時有體外試驗證實，IL-36Ra可有效抑制IL-36γ誘導的原代星形膠質細胞內CCL2、IL-6表達升高[4]。進一步說明，IL-36R拮抗劑IL-36Ra可抑制脊髓星形膠質細胞向A1極化，進而抑制神經炎癥反應。

關于IL-36Ra抑制A1型星形膠質細胞極化的分子機制，尚未完全闡明。有研究表明，小膠質細胞激活后釋放的IL-1α、TNF-α和C1q可在直接體外誘導星形膠質細胞激活并向A1表型極化[12]。CFA炎性痛小鼠脊髓內，已證實存在小膠質細胞激活、TNF-α炎癥因子大量生成等病理變化[13]。因此，我們推測在炎性痛造模后，脊髓小膠質細胞激活并釋放促炎性細胞因子，進而誘導星形膠質細胞向A1型極化。雖然有研究表明，抑制神經痛大鼠脊髓小膠質細胞激活可阻止星形膠質細胞A1型極化[14]。但IL-36Ra可直接與星形膠質細胞表面IL-36R結合并阻斷第二受體IL-1RAcP的募集來拮抗下游信號通路，調節星形膠質細胞活性[15]。有證據表明，IL-36Ra可抑制脊髓星形膠質細胞內JNK、NF-κB等信號通路激活[4]。因此我們認為，IL-36Ra可通過直接調控星形膠質細胞內信號通路，而非通過抑制小膠質細胞激活，來阻斷脊髓A1型星形膠質細胞極化。

綜上所述，CFA小鼠脊髓內星形膠質細胞激活并向A1型表型極化，IL-36Ra可抑制星形膠質細胞向A1型極化并緩解炎性痛。本研究結果首次證實了IL-36R對脊髓A1型星形膠質細胞極化的調節作用，為神經元-星形膠質細胞間的功能調節提供了新的線索與思路，而IL-36Ra可能成為外周炎性痛有效的治療藥物。