DHM抑制海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙

李夢(mèng)偉，呂慧婕,2，王紫涵，羅金定，丁星星，何劍琴，楊絲絲，奉水東，凌宏艷

(1. 南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.吉首大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，湖南 湘西 416000； 3. 南華大學(xué)船山學(xué)院，4. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

隨著當(dāng)代經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，糖尿病患者逐漸增長(zhǎng)。糖尿病會(huì)累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、導(dǎo)致認(rèn)知功能損害，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，從而影響人們的正常生活。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能是由于腦血管病變以及線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激等因素?fù)p害神經(jīng)元[1]，也有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可導(dǎo)致海馬損傷，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[2]。

DHM(dihydromyricetin，DHM)是一種多酚羥基二氫黃酮類(lèi)化合物，研究表明DHM具有抗炎、抗氧化及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病保護(hù)作用[3]。又有研究發(fā)現(xiàn)，格列齊特聯(lián)合二氫楊梅素可使葡萄糖穩(wěn)態(tài)、血脂狀況和炎癥狀態(tài)正常化，用于治療二型糖尿病[4]。Liu等[5]研究顯示，斛堿和二甲雙胍通過(guò)抑制ERS來(lái)改善衰老期小鼠的認(rèn)知功能障礙。Takano等[6]發(fā)現(xiàn)，甲氧基黃酮(一種黃酮類(lèi)化合物)具有抗氧化作用，通過(guò)抑制ERS來(lái)緩解MIN6細(xì)胞的死亡。也有研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素通過(guò)抑制ERS來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞氧化損傷[7]。但DHM是否可通過(guò)抑制ERS改善2型糖尿病認(rèn)知功能障礙，未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合低劑量STZ(30 mg·kg-1)建立2型糖尿病大鼠模型，用DHM處理，觀察DHM對(duì)T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙的影響，并探討其機(jī)制是否與抑制海馬ERS有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7～8周雄性Sprague Dawley大鼠(體質(zhì)量為260～280 g)由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(湘)2014-0011。動(dòng)物房?jī)?nèi)12 h明暗交替，將溫度設(shè)為23 ℃～24 ℃，濕度為40%～60%，保證充足的水和鼠糧。實(shí)驗(yàn)操作遵照《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑牛磺熊去氧膽酸(HY-19696)和衣霉素(HY-A0098)購(gòu)于MCE公司，鏈脲佐菌素(S0130)購(gòu)于Sigma公司，二氫楊梅素(27200-12-0)由張家界志誠(chéng)生物科技有限公司提供，GRP78抗體(GB12098)購(gòu)于賽維爾公司，p-PERK(SC4332)抗體購(gòu)于碧云天公司。

1.3 儀器奧林巴斯生物公司的-80 ℃超低溫冰箱(MDF-86V838)，其林貝爾生物公司的高速低溫離心機(jī)(H4-20KR)、搖擺型脫色搖床(TS-1型)，美國(guó)Bio-Rad公司的電泳槽/轉(zhuǎn)印槽(1703930)。

1.4 T2DM大鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組116只雄性SD大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選出56只作為正常對(duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠為2型糖尿病模型組(T2DM組，共60只):高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，空腹過(guò)夜，稱重后用三諾血糖儀測(cè)定空腹血糖。隨后分別一次性腹腔注射無(wú)菌檸檬酸鹽緩沖液(30 mg·kg-1)或低劑量STZ(30 mg·kg-1)，接著普通飼料或高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4周后，大鼠進(jìn)行空腹血糖和血清胰島素(Elisa方法)檢測(cè)，當(dāng)空腹血糖>16.7 mmol·L-1時(shí)則2型糖尿病大鼠模型建立成功(造模過(guò)程中死亡2只，失敗2只)。隨后2組大鼠分別用雙蒸水(1次/天，灌胃)或用DHM處理(250 mg·kg-1·d-1，灌胃)12周。12周后，每組隨機(jī)選取8只進(jìn)行水迷宮和Y迷宮檢測(cè)。各組剩余大鼠進(jìn)行側(cè)腦室置管給藥，實(shí)驗(yàn)分組如下：

1.4.1觀察ERS是否參與T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙 Control組和T2DM組大鼠分別在行為學(xué)檢測(cè)前3 d側(cè)腦室置管注射與ERS拮抗劑牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA，10 μg·d-1)等體積的生理鹽水或TUDCA，每天1次，連續(xù)3 d，因此實(shí)驗(yàn)分為4組：Control組、T2DM組、Control+TUDCA組和T2DM+TUDCA組(n=8)。

1.4.2觀察DHM對(duì)T2DM認(rèn)知功能改善作用是否與ERS有關(guān) Control組、T2DM+DHM組大鼠分別在行為學(xué)檢測(cè)前1天通過(guò)側(cè)腦室置管注射與ERS激活劑衣霉素(tunicamycin，TUN，10 μL)等體積的生理鹽水或TUN，T2DM組于同一時(shí)間注射與TUN等體積的生理鹽水，Control+DHM組注射TUN(10 μL)。因此實(shí)驗(yàn)分為6組：Control組、T2DM組、T2DM+DHM組、Control+TUN組、Control+DHM+TUN組、T2DM+DHM+TUN組(n=8)。

1.5 血糖測(cè)量大鼠禁食過(guò)夜，12 h后采血針刺破大鼠尾部流出靜脈血，用三諾血糖測(cè)試儀測(cè)量空腹血糖。

1.6 血清胰島素測(cè)量取大鼠尾巴靜脈血，在 13 000 r·min-1離心30 min后取血清，用大鼠胰島素Elise試劑盒進(jìn)行血清胰島素水平的檢測(cè)。

1.7 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)Y迷宮實(shí)驗(yàn)：Y迷宮有三個(gè)等長(zhǎng)互為120°的臂，將大鼠放入一個(gè)臂末端，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)5 min，錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠的入臂穿梭總次數(shù)。交替數(shù)為進(jìn)入Y迷宮3個(gè)臂為1次，Y迷宮的統(tǒng)計(jì)值是自發(fā)交替率，其計(jì)算公式為：交替率/%=[(交替數(shù))/(入臂總次數(shù)-2)]×100。

水迷宮實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)將一個(gè)圓形水池等分為4個(gè)扇形象限，水溫控制在22 ℃左右，水中加入二氧化鈦，攪拌使水不透明呈乳白色，將一個(gè)平臺(tái)放在第一象限中央，其頂部距離水面1 cm。d 1～5是獲得性訓(xùn)練期，每天同一時(shí)間將大鼠放入水中，記錄大鼠到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間，即為潛伏期。若大鼠潛伏期超過(guò)120 s，則人為引導(dǎo)大鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)滯留20 s。連續(xù)訓(xùn)練5 d，每次訓(xùn)練結(jié)束后用干毛巾將大鼠擦干，放回原飼養(yǎng)鼠盒內(nèi)。D 6是空間探索實(shí)驗(yàn):撤離平臺(tái)，讓每只大鼠放入后自由游泳120 s，攝像記錄大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)以及運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.8 側(cè)腦室置管給藥大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定在腦立體定位儀，在左側(cè)腦室(以正中線與兩耳連線的交點(diǎn)為起點(diǎn),向后移動(dòng)0.8 mm,向左移動(dòng)1.5 mm)插入注射管(插入深度為2.5 mm)并固定在大鼠顱骨上，把藥物從注射管中注射到左側(cè)腦室。

1.9 Western blot檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK的表達(dá)取各組大鼠海馬組織30 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入抗GRP78、p-PERK抗體，4 ℃搖床過(guò)夜后洗滌再加入二抗，接著加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑(1 ∶1)進(jìn)行反應(yīng)。曝光后進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 成功建立T2DM大鼠模型如Fig 1：T2DM組大鼠血糖>16.7 mmol·L-1，Elisa結(jié)果顯示：T2DM組血清胰島素明顯高于Control組大鼠，說(shuō)明T2DM大鼠模型成功。

Fig 1 Blood glucose and insulin levels in control and T2DM rats n=56)

2.2 DHM改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，T2DM組大鼠自發(fā)交替率明顯減少；而DHM明顯增加了大鼠的自發(fā)交替率(Fig 2A)；各組大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)無(wú)明顯差異(Fig 2B)，提示：DHM可改善T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。Fig 3A顯示d 1和d 5各組大鼠的游泳軌跡。與T2DM組相比，T2DM+DHM組大鼠逃避潛伏期減少，停留的時(shí)間百分比以及穿過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)明顯增加(Fig 3B-D)；提示二氫楊梅素可改善T2DM大鼠空間記憶能力。此外，各組大鼠逃避潛伏期和游泳速度沒(méi)有差異(Fig 3E，F(xiàn))。綜上所述，DHM可改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙。

2.3 ERS參與了T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙Y迷宮實(shí)驗(yàn)：與Control組相比，T2DM大鼠自發(fā)交替率減少,而T2DM+TUDCA組自發(fā)交替率明顯增加(Fig 4A)；各組大鼠入臂總次數(shù)不變(Fig 4B)。表明：TUDCA能夠改善T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。Fig 5A顯示d 1和d 5尋各組大鼠游泳軌跡。與T2DM組相比，T2DM+TUDCA組大鼠逃避潛伏期明顯減少，停留時(shí)間的百分比和穿過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)顯著增加(Fig 5B-D)；提示TUDCA可改善T2DM大鼠空間記憶能力。各組大鼠逃避潛伏期和游泳速度無(wú)差異(Fig 5E,F)。Western blot結(jié)果顯示：T2DM+TUDCA組大鼠海馬GRP78和p-PERK蛋白的表達(dá)明顯低于T2DM組(Fig 6)，提示TUDCA能夠抑制ERS蛋白的表達(dá)。綜上證實(shí)：TUDCA可改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙，即抑制海馬ERS能夠改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙。

Fig 2 Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group of rats n=8)

Fig 3 Comparison of behavioral indexes of Morris water maze in each group of n=8)

Fig 4 Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group of rats n=8)

2.4 DHM改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制：抑制海馬ERS為進(jìn)一步探討DHM改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制，我們使用ERS激動(dòng)劑(TUN)處理，Y迷宮結(jié)果顯示：與T2DM組相比，T2DM+DHM組大鼠自發(fā)交替率明顯增加，而與T2DM+DHM組相比，T2DM+DHM+TUN組大鼠自發(fā)交替率明顯減少(Fig 7A)；各組入臂總次數(shù)相同(Fig 7B)，提示：激活海馬ERS降低DHM對(duì)T2DM大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用。Fig 8A顯示d 1和d 5各組大鼠游泳軌跡。與T2DM+DHM組相比，T2DM+DHM+TUN組大鼠潛伏期明顯增加, 停留時(shí)間的百分比和穿過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)減少(Figure8B-D)；提示：激活海馬ERS可降低DHM改善T2DM大鼠的空間記憶能力。此外各組大鼠逃避潛伏期和游泳速度均沒(méi)有差異(Fig 8E、F)。Western blot結(jié)果顯示：T2DM+DHM+TUN組大鼠海馬GRP78和p-PERK蛋白表達(dá)增加更高于T2DM+DHM組(Fig 9)，說(shuō)明TUN能夠增強(qiáng)T2DM海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，即TUN可以促進(jìn)ERS的發(fā)生。上述結(jié)果證實(shí)：激活ERS能夠逆轉(zhuǎn)DHM對(duì)T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用。

3 討論

糖尿病是一種常見(jiàn)疾病，目前，糖尿病患病率和發(fā)病率急劇增加，糖尿病患者中90%以上是2型糖尿病(Type 2 Diabetes，T2DM)，T2DM會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥，如心臟病、腦血管等疾病，糖尿病中后期常伴有周?chē)窠?jīng)病變、大血管病變等嚴(yán)重并發(fā)癥。有研究表明，糖尿病患認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)正常人增加超過(guò)20%[8]，糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙(diabetic cognitive impairment，DCI)引起人們廣泛關(guān)注，雖然DCI的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但已證實(shí)海馬神經(jīng)元活動(dòng)異常、氧化應(yīng)激和星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷是DIC的潛在原因[9]，但目前臨床上對(duì)于DCI的治療還沒(méi)有特定的藥物。

二氫楊梅素(DHM)是從香葉安眠草莖和葉中提取的類(lèi)黃酮化合物的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化和清除自由基的能力[10]。我們前期研究證實(shí)DHM能夠改善高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[11]，表明DHM對(duì)神經(jīng)元的損傷具有有效的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用STZ聯(lián)合高糖高脂誘導(dǎo)2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，接著用DHM處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DHM可改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙，隨后我們進(jìn)一步探討其機(jī)制。

Fig 5 Comparison of behavioral indexes of Morris water maze in each group of rats n=8)

Fig 6 The protein expression of Bip and p-PERK in each group of rats n=5)

Fig 7 Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group of rats n=8)

Fig 8 Comparison of behavioral indexes of Morris water maze in each group of rats n=8)

Fig 9 The protein expression of Bip and p-PERK in each group of rats n=5)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是細(xì)胞為應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集等狀況,從而激活未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)等信號(hào)途徑的反應(yīng)過(guò)程。ERS被認(rèn)為是多種慢性神經(jīng)疾病的致病因素，在神經(jīng)退行性疾病、腦缺血和糖尿病神經(jīng)病變等神經(jīng)疾病中有著重要的作用[12]。研究表明，ERS途徑參與糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，并促進(jìn)認(rèn)知功能損傷[13]，并且ERS通路的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)變性和認(rèn)知功能障礙[14]；相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑制ERS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),可保護(hù)高糖誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷,進(jìn)而提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[15]。Ye等[16]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，天麻素通過(guò)抑制ERS和NLRP3炎癥小體激活改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙；又有研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素對(duì)Caco-2細(xì)胞具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與減少ERS，降低caspase-3的裂解有關(guān)[17]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和增強(qiáng)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，改善2型糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙[18]。 因此，我們猜測(cè)DHM是否可通過(guò)抑制海馬ERS來(lái)改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先觀察到抑制ERS可改善2型糖尿病認(rèn)知功能障礙，然后使用ERS激動(dòng)劑作用于DHM處理的T2DM大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活ERS可降低DHM對(duì)2型糖尿病認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用,提示：DHM可能通過(guò)抑制ERS改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DHM改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與抑制ERS有關(guān)，該研究為糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制及防治提供有價(jià)值的思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。