海昆腎喜膠囊通過激活自噬改善SAMP8小鼠認知功能障礙

張 松，王振國，陳宇航，蘭江純，何 珊,，張秀云

(山東中醫藥大學1.藥學院；2.中醫藥經典理論教育部重點實驗室，山東 濟南 250355)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年性癡呆中發病率最高的一種神經系統性疾病，臨床上以記憶衰退、學習及認知障礙為特征，主要的臨床病理學標志為腦內β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)異常積聚以及細胞內Tau蛋白過度磷酸化[1]。研究顯示，AD發病機制復雜，多與腦內異常蛋白質積聚有關，特別是Aβ的過度產生及清除不足是關鍵誘因，促進其清除或是防治此癥的重要策略[2]。而自噬作為細胞內錯誤折疊蛋白質清除的關鍵途徑，在神經系統疾病發病中作用顯著[3]。

AD屬中醫“呆病”、“健忘”、“善忘”等范疇，近代中醫多傾向從“腎虛”論治。隨著研究深入，發現“毒損腦絡”、“濁毒損腦”也是AD的重要病機[4]。而過度沉積的Aβ和過度磷酸化的Tau蛋白，是機體腎精虧虛、臟腑功能紊亂產生的痰濁瘀血，直接損傷腦髓，屬“內生濁毒”范疇[4-5]。而自噬可降解過量沉積的蛋白，清除痰濁瘀血[5]，對于神經細胞內Aβ等的清除及減輕其毒性發揮重要作用[3]。所以，自噬通路為化濁/祛瘀中藥防治AD的研究提供了新的思路。

海昆腎喜(HKSX)膠囊主要成分為中藥昆布中提取的褐藻糖膠，是由α-L-巖藻糖-4-硫酸酯形成的水溶性雜多糖，有化濁、排毒之效。臨床上用于慢性腎功能衰竭濕濁證[6]。此外，研究發現HKSX可以改善AD模型小鼠空間學習記憶障礙，提高腦內乙酰膽堿含量[7]，但具體機制尚不清楚。

HKSX化濁排毒，其對AD的干預作用是否與自噬相關？因此，本實驗采用近交系快速老化P8(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)小鼠模擬人類衰老導致的學習記憶障礙，探討HKSX是否通過調節自噬實現其對AD的干預作用，為其防治AD的臨床應用提供科學依據，并為其他化濁/化瘀類中藥防治AD的作用機制研究提供思路。

1 材料

1.1 實驗動物16周齡雄性SAMP8小鼠48只，同周齡雄性抗快速老化小鼠1(senescence-accelerated mouse/resistance 1，SAMR1)小鼠16只，均為SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于山東中醫藥大學實驗動物中心屏障設施，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0010。

1.2 實驗主要試劑HKSX膠囊(吉林省輝南長龍生化藥業股份有限公司， 015200507)，Aβ1-40ELISA試劑盒(酶聯生物，m1001859)，Aβ1-42ELISA試劑盒(酶聯生物，m1002201)，Radio Immunoprecipitation Assay(RIPA)裂解液(碧云天生物，P0013B)，BCA蛋白定量/濃度測定試劑盒(500 T)(美侖生物,MA0082-1)，PAGE凝膠超快速制備試劑盒10%(美侖生物,MA0382)，10X蛋白電泳緩沖液(美侖生物，PK10002)，PVDF膜(0.22 μm)(Merck Millipore，ISEQ00010)，10X電泳轉移緩沖液(索萊寶，D1060)，TBST緩沖液(美侖生物，T1081)，兔抗Beclin-1(Cell Signaling TECHNOLOGY，3495)、兔抗LC3B(Cell Signaling TECHNOLOGY，2775)、兔抗SQSTM1/p62(Cell Signaling TECHNOLOGY，5114)、兔抗Syn(Cell Signaling TECHNOLOGY，4329)、兔抗PSD95(Cell Signaling TECHNOLOGY，2507)、兔抗β-Actin(Cell Signaling TECHNOLOGY,4967)，兔抗GAPDH(proteintech，10494-1-AP)，Western一抗稀釋液(碧云天生物，P0023A)，山羊抗兔IgG/辣根酶標記(中杉金橋,ZB-2301)，靈敏ECL化學發光試劑盒(proteintech，PK10002)，甲醇(天津富宇，JC-01)

1.3 實驗主要儀器醫用離心機(湖南平凡科技有限公司，TGL-16A)，XR-SuperMaze動物行為分析系統、Morris水迷宮實驗系統、物體識別實驗系統(包括相同、不同物體)均為上海欣軟信息科技有限公司，新物體識別箱-小鼠(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，63040)，酶標儀(賽默飛，MultiskanSky)，微孔板恒溫振蕩器(杭州佑寧儀器有限公司，WZ80-2)，凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司，Tanon 4800Multi)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥將16 周齡SAMP8小鼠[8]隨機分成模型組(P8組)、HKSX低劑量組(L-HKSX組)、HKSX高劑量組(H-HKSX組)3組，同周齡SAMR1小鼠作為正常對照組(R1組)，每組16只。其中，HKSX低、高劑量組分別給予100、200 mg·kg-1·d-1(以其有效成分FPS的量計算，以人與小鼠的等效劑量比折算得到低劑量給藥量，上調一倍得到高劑量給藥劑量，給藥時都以超純水為溶媒)，R1組和P8組代之以同等體積的超純水灌胃，每日1次，連續給藥60 d(HKSX說明書中的一個療程)，之后進行行為學檢測。

2.2 行為學檢測

2.2.1新物體識別(New Object Recognition，NOR)實驗 首先進行NOR實驗，實驗歷時3 d。d 1：將小鼠放入40 cm×40 cm的曠場中自由探索5 min；d 2：使小鼠熟悉大小、顏色、形狀相同的兩物體5 min；d 3：換入一大小、顏色、形狀均不同的物體，再讓小鼠熟悉5 min，并記錄小鼠對兩物體的探索時間[9]。實驗全程由視頻分析系統跟蹤分析。每次實驗結束后，用75%乙醇溶液擦拭測試箱和物體，防止氣味干擾。結果用新物體識別指數(discriminition index)，即小鼠探究新物體所用時間占其探究兩物體所用時間和的比例表示。

2.2.2Morris水迷宮(Morris Water Maze，MWM)實驗 NOR實驗結束d 2進行MWM實驗。Morris水迷宮主要由圓形水池(直徑90 cm，高50 cm)、水下平臺(直徑9 cm，高35 cm)以及圖像采集分析系統SuperMaze組成，平臺放置于第四象限。測試時，水深36 cm，水溫為(22±2)℃，SuperMaze系統全程跟蹤記錄。實驗前1 d，讓小鼠自由游泳120 s，以便適應游泳環境。實驗中為減少對動物行為的影響，盡量保持水溫及外界環境穩定，SuperMaze系統全程跟蹤記錄。實驗方法參考以往實驗[10]。

(1)定位航行(acquisition trail)實驗 實驗共計6 d。每天以四個不同象限作入水點，將小鼠頭部面向池壁放入水中，小鼠找到隱藏平臺需要的時間記錄為逃避潛伏期(escape latency，EL)。如果在60 s內沒有找到平臺，則將小鼠引至平臺停15 s，以形成記憶，同時記錄逃避潛伏期為60 s。

(2)空間探索(probe trial)實驗 d 7撤去平臺，將小鼠從目標象限的對側象限(第二象限)以相同方法放入，記錄60 s內小鼠的游泳軌跡，分析其在目標象限的游泳時間和穿越平臺的次數。

2.3 標本采集行為學實驗結束后，小鼠斷頭，將海馬組織剝離出，稍吸干后稱重，置于-80 ℃冰箱保存，待測各項指標。

2.4 ELISA法測海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42的表達取2.3項下各組組織，按說明書操作提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度并調至同一濃度水平；按說明書操作設置標準孔、樣品孔和空白孔，分別加入相應試劑；封板膜封板，37 ℃溫育60 min；再經洗滌、加顯色液、避光孵育、加終止液等步驟，最后在450 nm波長下檢測各孔吸光度，根據標準曲線，算出組織中Aβ1-40和Aβ1-42的表達[11]。

2.5 Western blot檢測方法參考以往實驗[12]，取2.3項下各組組織，按說明書操作提取總蛋白，BCA法定量各組蛋白濃度并調至同一水平；SDS-PAGE電泳分離，每孔上樣10 μL；轉膜；5%脫脂奶粉封閉2 h；一抗(p62，1 ∶1 500；LC3B，1 ∶1 500；Beclin-1，1 ∶1 500；PSD95，1 ∶1 500；Syn，1 ∶1 500；β-actin，1 ∶2 500；GAPDH，1 ∶6 750)4 ℃過夜孵育；二抗室溫孵育1 h；ECL化學發光成像，Image J軟件分析蛋白表達量。

3 結果

3.1 HKSX膠囊改善SAMP8小鼠學習、記憶能力

3.1.1NOR實驗 NOR測試是一種敏感的認知能力測定，如果實驗動物在d 2 已經對兩個相同物體形成記憶，那么在d 3的識別階段，它們將花費更多時間來探索新物體[9]。如Fig 1所示，NOR實驗中，與R1小鼠相比，P8組小鼠明顯降低對新物體的辨別力(P<0.01)；給藥后，低、高劑量組小鼠對新物體的識別指數均有所增加(P<0.05，P<0.01)，由此可見，HKSX能提高AD小鼠對新物體的分辨能力和識別率，改善其學習、記憶障礙。

3.1.2HKSX膠囊改善小鼠定位航行和空間探索能力 如Fig 2A、B所示，在定位航行實驗中，AD模型組小鼠尋找逃避平臺的時間最長，且隨訓練天數的延長無明顯改善，說明SAMP8小鼠的學習記憶能力較差；而正常組小鼠訓練過程中逃避潛伏期明顯縮短，提示其學習適應能力較強。給藥組小鼠尋找平臺所需的逃避潛伏期明顯降低，說明HKSX可以明顯改善SAMP8小鼠的學習能力，且以高劑量組效果更佳。

分析圖2C-E，與R1組相較，P8組小鼠在目標象限的停留時間和穿越平臺的次數明顯偏少(P<0.01)，說明AD小鼠的確存在記憶障礙；而與模型組相比，HKSX高、低劑量都能改善這一現象，即HKSX很大程度上提高SAMP8小鼠的學習、記憶及記憶再提取的能力，且高劑量組的改善效果更好(P<0.01)。

3.2 HKSX膠囊降低SAMP8小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平ELISA實驗顯示(Fig 3)，與R1組相比，P8組小鼠腦內Aβ1-40和Aβ1-42水平均有大幅度增多(P<0.01)，而L-HKSX組和H-HKSX

Fig 1 Effect of HKSX on memory ability of SAMP8 mice in NOR Test n=16)

Fig 2 HKSX improved learning and memory function of SAMP8 mice in MWM test n=16)

Fig 3 Effect of HKSX on level of Aβ1-40 and Aβ1-42 in SAMP8 mice n=8)

組小鼠腦內Aβ1-40和Aβ1-42水平較于P8組均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，尤其H-HKSX的清除效果更明顯。說明HKSX可清除Aβ在腦組織中的過度沉積，降低其帶來的神經毒性損傷，進而對AD起到防治效果。

3.3 HKSX膠囊調節自噬相關蛋白表達，激活自噬如Fig 4所示，與R1組相比，P8組小鼠海馬組織p62蛋白表達明顯偏多(P<0.01)，而LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達量明顯減少(P<0.01)。這一相對

Fig 4 Effect of HKSX on expression of autophagy-related proteins in SAMP8 mice n=8)

表達趨勢說明模型組小鼠自噬功能受到損害。HKSX給藥后，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達明顯提升，同時下調p62水平，提示HKSX低、高劑量可不同程度激活自噬，改善自噬功能障礙，增強異常蛋白的清除，其以高劑量效果更明顯(P<0.01)。

3.4 HKSX膠囊提高突觸可塑性WB結果顯示(Fig 5)，相較于R1組，P8組小鼠腦內Syn、PSD95水平明顯降低(P<0.01)，表明P8組小鼠的突觸傳導受到阻滯，印證了AD確實可導致小鼠學習記憶能力障礙；與P8組相比，低、高劑量HKSX均能上調Syn、PSD95在海馬組織中的表達(P<0.05，P<0.01)，增加神經突觸可塑性，增強突觸傳導，最終達到干預AD的目的。

Fig 5 Effect of HKSX on expression of synaptic plasticity-related proteins in SAMP8 mice n=8)

4 討論

自噬是真核細胞中發生的一種自我降解的過程，可以吞噬損傷的細胞器、錯誤折疊的蛋白等廢物，供給細胞重新利用或排出體外，從而維持細胞結構和功能、延緩衰老[5]。研究表明，隨著機體衰老，自噬水平明顯下降[13]。而上調自噬功能，Aβ蛋白的異常聚集及其導致的神經元死亡都能夠表現出減緩的現象[14-15]。因此，激活自噬的發生為AD治療提供了新的視角。

細胞自噬受多條信號通路調節，其中Beclin-1、LC3和p62是參與自噬的重要蛋白[3,14]。Beclin-1參與自噬起始階段，可形成Beclin1-Vps34-Vps15復合結構而啟動自噬、促進吞噬泡成核并召募蛋白形成自噬前體[14]。LC3能被Atg4激活成LC3-Ⅰ，并與磷脂酰乙醇胺連接成復合物，參與調控自噬體擴散和延展過程[3]。p62與泛素化蛋白和LC3-Ⅱ結合成復合體，啟動自噬體形成，而自身則會連接異常致病蛋白一同被自噬溶酶體降解[16]。研究表明，自噬相關蛋白Beclin-1在AD患者腦中減少，p62含量增加，LC3-Ⅱ水平與AD樣本的Aβ斑塊密切相關，載滿未消化Aβ等底物的自噬結構則驗證了AD小鼠確實存在自噬受損的情況[14]。

HKSX的成分為中藥昆布中提取的褐藻糖膠，為昆布的主要活性成分。《本草綱目》記載，昆布性寒，咸，歸經于肝，胃，腎經，有消毒解痰，軟堅散結，利尿活水、化瘀消腫等重要功效，用于治療癭瘤，瘰疬，睪丸腫痛，痰飲水腫等病癥。所以，從中醫中藥學分析，HKSX善利水化痰，適用于癥瘕痰瘀膠結之證。如前所述，自噬功能障礙可能是AD“濁毒損腦”發病的微觀機制，細胞自噬則是消除內生痰濁瘀血的重要機制[5]，而HKSX可以化濁排毒，所以推測HKSX可以通過激活自噬，改善AD認知障礙。

藥效學實驗表明，HKSX可提高SAMP8小鼠對新穎物體的識別指數，且明顯縮短水迷宮實驗中小鼠的逃避潛伏期，增加其在目標象限停留時間和穿越平臺的次數，ELISA結果顯示腦內Aβ水平減少。這表明，HKSX可以化濁排毒，促進Aβ的降解，從而改善記憶，那么其作用機制是否與自噬有關？Wenstern btot研究結果表明，自噬相關基因Beclin-1、LC3-Ⅱ在SAMP8小鼠中表達下降，而p62表達水平上升，說明AD小鼠的自噬功能的確是損傷的；而HKSX治療能調節上調Beclin-1、LC3-Ⅱ表達，下調p62水平，以激活自噬。

此外，Syn和PSD95主要調節神經元突觸的形成和突觸可塑性改變，研究表明Syn和PSD95含量下降現象存在于AD模型小鼠的大腦海馬組織中[17]。我們同樣發現SAMP8小鼠海馬組織中Syn和PSD95蛋白表達下調，表明在SAMP8小鼠中神經元突觸形成及功能障礙。而HKSX給藥后，蛋白Syn和PSD95表達量增多，表明HKSX可以促進突觸結構的重建，改善突觸傳導和神經信息的傳遞。

總之，本文結果表明HKSX膠囊可以上調自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ，同時下調p62含量，改善自噬功能障礙，進而減少腦內Aβ的異常集聚，減輕神經毒性作用；并且提高了PSD95和Syn蛋白的表達量，提高神經元的突觸可塑性，進而改善SAMP8小鼠的學習和記憶障礙。關于HKSX膠囊如何調節自噬，目前的研究表明，多糖在腸道菌群的發酵下代謝產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，而SCFAs在“腸-腦軸”相互作用中具有關鍵作用[18]，腸道內游離的SCFAs可以通過單羧酸轉運蛋白穿過血腦屏障；此外，SCFAs還可以通過G蛋白偶聯受體結合，進一步調節腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinas, AMPK)、核因子等信號通路，從而直接或間接影響腦功能[18]。而其中AMPK信號通路與自噬密切相關[14]，這些結果為我們下一步詳細的機制研究提供了啟示和思路。