農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系的建立

殷 敏

（寧夏葡萄酒與防沙治沙職業技術學院，寧夏 銀川 750001）

水稻是重要的糧食作物，其產量對保障我國糧食安全具有重要意義。利用植物基因工程技術將抗逆、豐產基因通過農桿菌介導法[1-4]轉化水稻可以提高水稻的抗逆性、產量。目前，對于水稻材料，農桿菌介導的遺傳轉化體系已經很成熟，但是寧夏回族自治區選育出來的水稻品種在農桿菌介導的遺傳轉化方面明顯滯后，報道較少。為此，首先建立寧夏回族自治區水稻高頻再生體系，培養出高品質的水稻愈傷組織，然后通過農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織，建立水稻遺傳轉化體系，為通過基因工程技術提高寧夏回族自治區水稻抗逆性、產量奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

水稻材料為寧粳23號、寧粳25號、寧粳27號、寧粳29號、寧粳33號、寧粳35號、寧粳38號、寧粳40號、寧粳花89號。

農桿菌菌株為EHA105（已經將含有卡那霉素、羧芐青霉素抗性基因的質粒轉化進該農桿菌菌株），由寧夏葡萄酒與防沙治沙職業技術學院保存。

培養基為YEP培養基和MS培養基[5-6]。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的培養挑選籽粒飽滿的水稻種子，剝去穎殼，去掉發黑的種子，選取干凈完整的種子浸泡在75%乙醇溶液中4~6 min進行殺菌消毒，然后用0.1%氯化汞消毒15 min（可在搖床上進行），最后用無菌水沖洗3~4次。將沖洗干凈的種子放在無菌濾紙上，待水分被吸干，分別置于含有不同質量濃度脫落酸（ABA，0、1 mg/L）的MS培養基（MS+ABA培養基）中，然后分別在光照、黑暗條件下培養12~15 d，確定最佳培養條件。在最佳培養條件下，按照上述步驟操作然后將種子置于含有不同質量濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，0、1、2、3、4、5 mg/L）的MS+ABA培養基中培養12~15 d，誘導形成愈傷組織，挑取優質愈傷組織進行繼代培養。

1.2.2 農桿菌菌液的培養先將農桿菌菌株用pH值7.2～7.4的YEP培養基培養，然后蘸取少量該菌液在YEP固體培養基 （含80 mg/L 卡那霉素）上接種劃線，用封口膜密封培養皿放置在27 ℃的恒溫培養箱中暗培養40～46 h，至長出半徑約0.6 mm的單菌落。從培養成熟的單菌落平板上挑取單個菌落接種于10 mL含80 mg/L 卡那霉素的YEP液體培養基中，置于220 r/min的27 ℃搖床上振蕩培養約16 h，至OD600約為0.5。然后將此菌液轉接于100 mL含有80 mg/L 卡那霉素的YEP液體培養基中，在27 ℃、220 r/min恒溫搖床上繼續振蕩培養6～7 h,至OD600約為0.5。最后將此菌液倒入高壓滅菌的離心管中以3 000 r/min 離心20 min, 將上清液倒掉后加入含有90μmol/L乙酰丁香酮、pH值5.5的MS液體培養基。

1.2.3 農桿菌侵染愈傷組織并與愈傷組織共培養在超凈工作臺上，取出繼代12 d的胚性愈傷組織，放入已滅菌的培養皿內，加入已培養好的農桿菌菌液，并不斷搖動，使愈傷組織與農桿菌充分接觸，浸泡15 min。然后將愈傷組織取出，用無菌濾紙吸干愈傷組織表面水分。最后將愈傷組織接入覆蓋有1層無菌濾紙的固體共培養基（MS+2 mg/L 2，4–D+0.6 g/L水解酪蛋白+0.6 g/L L-脯氨酸+25 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂，pH值5.5）中，分別于27 ℃暗培養1、2、3、4、5 d。

1.2.4 抗性愈傷組織的篩選及轉基因植株的獲得將共培養后的愈傷組織分別置于含0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 mg/L羧芐青霉素的MS培養基中進行抗性篩選。然后置于分化培養基[5]中進行分化培養。待綠芽發育成3 cm長的小苗后，將其轉入生根培養基[5]中繼續培養，15~16 d后觀察綠苗的生根情況，待根系長到約2 cm，移栽到花盆于溫室中培養。

2 結果與分析

2.1 ABA對水稻愈傷組織誘導的影響

將不同水稻品種接種在含有ABA和不含有ABA的MS培養基上，篩選誘導產生愈傷組織最佳的水稻品種。結果表明，寧粳27號在加ABA的培養基上培養出愈傷組織所用時間最短，愈傷組織長勢良好；其次是寧粳33號，用時較短，長勢也較好（表1）。因此，選擇寧粳27號和寧粳33號進行后續試驗。

表1 ABA對水稻愈傷組織誘導的影響

2.2 光照與黑暗對水稻愈傷組織誘導的影響

由表2可知，在培養13 d時，黑暗條件下愈傷組織的誘導率接近50%，遠高于光照，并且黑暗條件下培養的愈傷組織色黃、質密，狀態較好；而光照條件下培養的愈傷組織出現玻璃化、水性化。因此，黑暗條件下進行愈傷組織誘導最佳。另外，寧粳27號愈傷組織誘導率高于寧粳33號，故后續試驗使用寧粳27號。

表2 光照與黑暗對水稻愈傷組織誘導率的影響 %

2.3 不同質量濃度2，4-D對水稻愈傷組織誘導的影響

在添加不同質量濃度2，4-D 的MS+1 mg/L ABA培養基上接種寧粳27號，發現當2，4-D質量濃度為3 mg/L時，愈傷組織的誘導率最高，為33.72%（表3）。因此，2， 4-D 質量濃度以3 mg/L最佳。

表3 不同質量濃度2，4-D對水稻愈傷組織誘導的影響

2.4 共培養時間對水稻抗性愈傷組織成活率的影響

由表4可知，愈傷組織與農桿菌共培養1 d, 愈傷組織的污染率最低，獲得的抗性愈傷組織數占17 %；共培養3 d,獲得的抗性愈傷組織數最多，達21%；當共培養時間超過3 d，愈傷組織的污染率迅猛增加，獲得的抗性愈傷組織數迅速減少；當時間延長至5 d時，獲得的抗性愈傷組織數僅為1%。因此，愈傷組織與農桿菌的共培養時間以3 d最佳。

表4 共培養時間對水稻抗性愈傷組織成活率的影響

2.5 不同質量濃度羧芐青霉素對抗性愈傷組織成活率的影響

本研究發現，當羧芐青霉素質量濃度低于150 mg/ L時，農桿菌的生長不會被抑制，水稻愈傷組織被農桿菌污染；隨著羧芐青霉素質量濃度降低，愈傷組織的污染率升高，最終導致愈傷組織全部被農桿菌污染致死。當羧芐青霉素質量濃度高于150 mg/L時，隨著羧芐青霉素質量濃度的升高，愈傷組織的生長受到抑制。當羧芐青霉素質量濃度為150 mg/L時，共培養后愈傷組織的成活率最高，為39%。因此，羧芐青霉素質量濃度以150 mg/L最佳。

3 結論與討論

本研究對9個水稻品種的愈傷組織誘導率進行比較，發現不同水稻品種的愈傷組織誘導率不同，愈傷組織誘導率最高的水稻品種是寧粳27號。這可能與不同基因型水稻所含有的內源激素種類和含量不同有關[3-4]。本研究探討了不同ABA質量濃度（0、1 mg/L）、培養條件（光照、黑暗）、2，4-D質量濃度（0、1、2、3、4、5 mg/L）、共培養時間（1、2、3、4、5 d）、羧芐青霉素質量濃度（0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 mg/L）對寧夏回族自治區水稻愈傷組織誘導率、成活率的影響，以建立農桿菌介導的寧夏回族自治區水稻遺傳轉化體系。結果表明，最佳的ABA質量濃度為1 mg/L，最佳的培養條件是黑暗培養，最佳的2，4-D質量濃度為3 mg/L，最佳的共培養時間為3 d，最佳的羧芐青霉素質量濃度為150 mg/L。在此條件下，愈傷組織誘導率高、抗性愈傷組織多、轉化植株成活率高。