惡性卡他熱的診斷方法及研究進展

龐賢劍 王俐/廣西壯族自治區合浦縣動物疫病預防控制中心 536100

惡性卡他熱是一種在牛科和鹿科許多動物物種中具有明顯臨床表現和經常致病的疾病，病原為惡性卡他熱病毒。惡性卡他熱在世界許多國家被認為是造成主要家養反芻動物重大經濟損失的原因，并且對多種反芻動物混合飼養中的易感動物造成嚴重的威脅。由于發病機制及其流行病學的復雜性，在臨床上獸醫在診斷惡性卡他熱病毒單獨感染或多種病原混合感染疾病方面面臨重大挑戰。然而，最近開發的分子診斷檢測改進了惡性卡他熱病毒的檢測和區分，并提高了實驗室檢測在確認不同物種的惡性卡他熱感染方面的準確性。了解新開發的惡性卡他熱病毒診斷分析以及在每種流行病學情況下的適當應用對于適當利用這些分子診斷方法檢測惡性卡他病毒是必要的。惡性卡他熱的診斷方法是本綜述的重點論述方面。

1 惡性卡他熱的臨床癥狀及流行病學

當從宿主之間傳播足夠病毒量的惡性卡他熱病毒時，惡性卡他熱會發生在多種臨床易感宿主中，例如牛、野牛、鹿和豬。疾病通常具有急性發作并涉及一系列癥狀，可能包括角膜混濁、大量眼部和鼻腔分泌物、腹瀉、淋巴結腫大、發燒和厭食。但基本病理特征的病變可能由于物種存在一些差異，但大體病變幾乎是一致的，包括廣泛的淋巴組織增生，血管和上皮壞死。一旦出現惡性卡他熱的臨床癥狀，傳播的病毒量不會影響病變嚴重程度，然而，傳播病毒量與潛伏期外周血白細胞中第一次通過聚合酶鏈反應（PCR）檢測惡性卡他熱病毒DNA 的時間顯著相關。臨床表現和病理特征在惡性卡他熱的診斷過程中都具有重要的診斷價值[。通過PCR 檢測外周血白細胞和組織中的惡性卡他熱病毒DNA，尤其是高水平的病毒DNA，可以支持惡性卡他熱病毒引起的疾病的診斷。

在一些研究中發現，不同病毒類型對反芻動物的易感性差異很大。與牛相比，野牛對惡性卡他熱病毒的敏感性更敏感，約為牛的1000 倍。盡管一旦出現臨床癥狀，惡性卡他熱在野牛、牛和某些鹿科物種中通常是致命的，但也可能出現亞臨床感染的情況。

惡性卡他熱可能發生在存在易感宿主且附近有臨床易感動物的地方。惡性卡他熱病毒傳播的從儲存宿主到臨床上易感宿主的流行病學調查結果顯示，病毒通過其宿主的鼻腔分泌物或眼分泌物釋放到環境中。臨床上易感的物種通過吸入獲得病毒，攝入受污染的食品或水中的含有病毒的分泌物也被認為是一種傳播途徑。密切接觸和低溫潮濕的環境可增強通過帶病毒分泌物的有效傳播，并可長距離傳播。惡性卡他熱不會通過自然方式從一個臨床易感宿主傳播到另一個，因為受影響的動物通常的結局為死亡。不同動物物種宿主感染的惡性卡他熱病毒毒株可存在不同，并在某些情況下可能會發生雙重感染。貯藏宿主中的感染通常是亞臨床的，如在綿羊和山羊中很少報道出現惡性卡他熱癥狀。

2 惡性卡他熱的診斷方法

2.1 惡性卡他熱的血清學檢測方法已經開發了幾種血清學檢測方法來檢測針對惡性卡他型病毒的抗體，這些檢測包括病毒中和（VN）、免疫印跡、酶聯免疫吸附檢測（ELISA）/競爭抑制 ELISA（cELISA）、免疫熒光檢測（IFA）/免疫過氧化物酶檢測（IPT）和補體結合檢測。這些測試可分為三類：基于中和抗體、多克隆抗體和單克隆抗體的檢測。病毒中和試驗具有高度的特異性，可以很好地檢測出不同動物物種的不同惡性卡他熱病毒型。基于多克隆抗體的檢測，包括 ELISA、IFA 和IPT 等，可檢測針對惡性卡他熱病毒多個表位的抗體。通常，這些測試具有良好的敏感性，但由于與其他皰疹病毒（如牛皰疹病毒1 和4）的交叉反應，特異性降低。為了提高特異性，使用針對迄今為止檢測的所有惡性卡他熱病毒中保守的表位的抗體（15-A）開發了用于檢測惡性卡他熱病毒抗體的cELISA。由于使用了單克隆抗體并與檢測酶直接結合，惡性卡他熱病毒的cELISA 具有很高的特異性和靈敏度。此外，cELISA 在多物種樣品檢測方面具有較高優勢，并且無需為每個被測試物種使用物種特異性酶標記物。此外，在cELISA 大量樣品檢測中占具有重要地位。

血清學測試還適合在野外調查無癥狀動物，檢測陽性結果表明動物感染惡性卡他熱病毒。幾乎所有惡性卡他熱病毒的宿主都可在被感染后持續產生抗體，這種抗體可以通過任何血清學測試檢測到。4 月齡以下未感染羔羊可能因存在母源抗體而血清學檢測結果呈抗體陽性，因此，不應使用血清學檢測來確定低日齡動物的感染狀態。然而，小于12 個月大的小動物，尤其是畜群較小的群體中的低日齡動物，可能會由于接觸感染動物傳播的低病毒量的惡性卡他熱病毒而抗體檢測結果呈陰性。總體而言，血清學對于確定成年宿主的感染狀態是可靠的。在牛、野牛和鹿等臨床易感物種中檢測到惡性卡他熱病毒抗體，也表明動物已感染。然而，由于這些物種中有很大一部分可以以亞臨床形式感染該病毒，只有與提示惡性卡他熱的組織病理學病變和臨床癥狀相互符合的情況下，抗體的存在才確定為動物感染惡性卡他熱病毒。

2.2 惡性卡他熱的分子生物學檢測方法PCR 已成為惡性卡他熱分子診斷的重要工具。PCR 檢測已廣泛應用于獸醫診斷實驗室；然而，將其用作檢測病毒DNA 以在診斷中確認臨床惡性卡他熱的常規方法可能存在問題，如因為擴增污染的可能性很高，從而導致診斷實驗室中的假陽性結果。用于實時定量PCR 的特異性引物探針組可顯示出臨床樣品的病毒量。惡性卡他熱分子診斷的另一個重大進展是對于于混合物種飼養場地，例如動物園、野生動物園和游戲農場，開發了用于檢測和區分已知會導致疾病的惡性卡他熱病毒的多重PCR。多重PCR 是一種種快速、可靠和鑒別臨床樣本中惡性卡他熱病毒的方法。

這些新開發的檢測方法在分子水平上顯著改進了惡性卡他熱的診斷方法，臨床上獸醫的關鍵問題是：應該使用哪種檢測方法？在惡性卡他熱的診斷中，首先考慮當地的流行病學信息很重要。在大多數情況下，應清楚該疾病是否與宿主有關，并且可以使用針對預期病毒的特定檢測。一般來說，所有樣本可以分為兩大類：臨床病例和亞臨床病例。易感宿主中，例如牛、野牛和鹿，均存在臨床和亞臨床型病例感染惡性卡他熱病毒的報道。在來自混合物種的臨床樣本中，建議使用多重PCR來確認哪種病毒是致病病毒。在無病的臨床易感宿主中確認感染通常是一個無關緊要的問題，因為導致牛和野牛惡性卡他熱亞臨床感染形式并不常見，而且病毒從受感染動物傳播到其群體的可能性很小。幾乎所有的宿主，如綿羊、山羊和角馬，都感染了惡性卡他熱病毒，它們的感染狀態通常可以通過血清學確認。在某些情況下，需要使用 PCR 來證明動物不攜帶有惡性卡他熱病毒。即使所有現有的PCR 均呈陰性，但在具有強烈的惡性卡他熱臨床和病理學特征的病例中仍可能存在未鑒定過的惡性卡他熱病毒。雖然擴增產物需要通過測序驗證，但泛特異性靶向皰疹病毒DNA 聚合酶基因的PCR 檢測是鑒定新型惡性卡他熱病毒的重要工具，并將繼續用于惡性卡他熱的診斷領域。

3 結語

現在有幾種新開發的分子診斷檢測方法可用于惡性卡他熱的診斷，但由于發病機制及其在不同物種（包括臨床易感宿主和宿主宿主）中的流行病學的復雜性，臨床上獸醫面臨的挑戰是選擇正確的檢測方法來確認該病或動物感染。惡性卡他熱病毒的天然宿主范圍廣泛，一般可分為兩類：一般宿主（如綿羊、山羊和角馬）和臨床易感宿主（如牛、野牛和鹿）。幾乎所有的宿主宿主都被感染，血清學檢測對于確定感染狀態是有用和有效的，但這不包括帶有母體抗體的低日齡動物的檢測。使用PCR 檢測和區分宿主宿主中的惡性卡他熱病毒通常僅用于非常特定的目的，例如，需要巢式PCR 來確定羔羊是否不攜帶惡性卡特熱病毒以便建立不含惡性卡他熱病毒的羊群。血清學和PCR 對在疑似患有惡性卡他熱的宿主中確認疾病幾乎沒有價值。臨床疾病和亞臨床感染均發生在臨床易感宿主中。巢式PCR 和實時定量PCR 均適用于檢測具有臨床惡性卡他熱的動物的白細胞和組織中的病毒DNA。建議將實時qPCR 用于常規檢測，因為該方法具有較高的靈敏度、高特異性和降低交叉污染的脆弱性。推薦血清學檢測，特別是cELISA，用于篩查臨床易感宿主的感染狀態，因為在亞臨床感染期間白細胞中病毒DNA 水平低，這可能導致PCR 檢測出現大量假陰性。隨著分子技術的進步和對疾病的進一步了解，在不久的將來可能會開發出具有更好敏感性、特異性和便利性的新一代惡性卡他熱檢測方法。