湖南油茶根際微生物的群落結構特征

唐 煒，陳隆升，陳永忠，彭映赫，劉彩霞

（1.湖南省林業科學院，湖南 長沙 410004；2.國家油茶工程技術研究中心，湖南 長沙 410004）

油茶是我國重要的木本食用油料樹種，油茶產業的發展對于我國的經濟發展、社會穩定、生態文明建設均具有重要的戰略意義[1]。油茶廣泛分布于我國南方地區，栽培區域土壤較為貧瘠。截至2019年底，湖南省油茶種植面積144.65萬hm2，油茶籽產量109.9萬t，茶油產量26.3萬t，油茶產業年總產值471.6億元，在擴大油茶林面積和提高產量、產值、科技水平等方面均取得了突出成效。但目前的茶油產量仍無法滿足我國的糧油自供需求，所以增加油茶茶果產量、提升茶油品質、提高資源利用率等問題亟待解決[2]。

土壤是油茶生長的物質基礎和支撐，而根際微生物是土壤中養分循環、能量轉化的最主要組成部分[3]。前人的研究結果表明，土壤環境是調控擬南芥、楊樹等林木根際微生物組結構的重要因子；Bonito等[4]對楊樹、櫟樹和松樹在3種土壤環境中的根際細菌和真菌群落進行分析，指出土壤性質對根際真菌群落組成的影響較大，宿主類型對根際細菌群落組成的影響較大。土壤pH、水分含量、碳氮含量比值、營養元素含量及土壤肥力等被認為是影響根際微生物組構建的重要因素[5-6]，地理位置在決定根際微生物的組成中也發揮著重要作用。Coleman-Derr等[7]研究了在墨西哥和美國的7個地區龍舌蘭根際細菌和真菌的群落結構，發現地理位置差異顯著影響龍舌蘭根際細菌和真菌的群落結構，且真菌受到的影響更大，這可能是真菌的地方擴散限制性造成的。通過比較美國不同氣候區域5座城市的玉米根際微生物組，Peiffer等[8]發現美國東北部不同城市的玉米根際微生物群落組成較為相似，中西部不同城市的群落組成差異較大，這說明不能根據地理位置距離來充分解釋根際微生物組的形成機制。植物類型也影響了根際微生物群落的構建[8-10]。Costa等[11]經研究發現，在不同土壤環境中，草莓的根際菌Actinobacteria組成相似，說明相較于土壤性質，植物種類在根際微生物組的形成中起著決定作用。Edwards等[12]指出，在控制條件下水稻根際微生物組的構建受土壤類型和宿主植物基因型的共同調控。Uroz等[13]研究了歐洲櫸木和挪威云杉根際細菌、真菌和古菌菌群的構建，結果表明，樹木品種對真菌和古菌的群落結構影響較大，對細菌的群落結構影響較小。在根際微生物群落的構建中究竟哪個因素起決定性作用尚未有一致的結論。

本研究中以油茶為研究對象，探究其根際微生物群落的特異性，研究不同立地條件、不同良種、不同撫育管理措施條件下油茶根際土壤微生物物種組成、群落結構及多樣性的差異，解析油茶土壤微生物群落結構特征，以期為油茶林的地力調控、精準施肥提供參考，為油茶的提質增效提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地分別位于長沙市路口鎮林場、長沙市天際嶺林場和邵陽縣七里山場。長沙市路口鎮林場（113°11′E，28°22′N）屬亞熱帶季風濕潤氣候，年平均氣溫16.8～17.2 ℃，年平均無霜期275 d，年平均降水量1 361.6 mm，土壤為紅壤，成土母巖為泥質板巖和第四紀紅土。長沙市天際嶺林場（113°02′E，28°06′N）屬亞熱帶季風濕潤氣候，年平均氣溫16～18 ℃，年平均相對濕度約為80%，年平均降水量1 200～1 700 mm，為低丘崗地地貌，土壤為第四紀紅色粘土網紋層母質發育的酸性紅壤。邵陽縣七里山場（111°35′E，27°08′N）屬中亞熱帶季風濕潤氣候，年平均氣溫16.9 ℃，無霜期平均為286.4 d，年平均降水量1 300.5 mm，土壤為紅壤。

1.2 試驗設計

在3個林場試驗區域內選取2009年栽培的XL1號油茶林，研究不同栽培區域油茶根際微生物的群落結構；在長沙市路口鎮林場選取2009年栽培的XL1、XL16、XL64和XL210共4個良種油茶林，研究不同油茶無性系根際微生物的群落結構特征；選擇邵陽縣七里山場撫育油茶林和未撫育管理的油茶林，比較其根際微生物群落結構特征。

每個試驗區域選取20 m×40 m的樣地，分別設置3個10 m×10 m的小樣方。2018年5月，在每個樣方（10 m×10 m）中，采集根系抖落土的混合土樣，將其儲存在-20 ℃的便攜式冰箱中。土壤樣品運至實驗室后過篩（2 mm），篩除植物組織、根和巖石等，提取DNA樣品并保存于-80 ℃冰箱中，剩下的土壤在陰涼處風干，用于進一步的化學分析。

1.3 指標測定

土壤pH采用電極法測定[14]；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀氧化分光光度法測定[15]；土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定[16]；土壤全磷含量采用微波消解并使用全自動化學分析儀Smartchem 200進行測定[17-18]；土壤全鉀含量使用微波消解-分光光度法測定[19]；土壤銨態氮和硝態氮含量采用分光光度法測定[20-21]；土壤速效磷含量使用Mehlich 3浸提全自動化學分析儀測定[22]；土壤速效鉀含量使用Mehlich 3浸提火焰分光光度計法測定[23]。土壤總DNA使用Powersoil DNA分離試劑盒（MoBio，Carlsbad，CA，USA）進行分離純化，根際微生物多樣性采用Miseq平臺高通量測序技術進行測定。

1.4 數據分析

使用Flash和Trimmomatic軟件對測序結果進行質量過濾和優質序列拼接，得到有效數據，采用RDP Classifier算法對操作分類單元（OTU）中代表序列進行比對分析，并在各水平注釋其群落的物種信息[24]。使用QIIME軟件計算樣品的α多樣性指數（Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數）；使用QIIME軟件計算β多樣性距離矩陣。使用R語言vegan軟件包對環境因子和土壤菌群群落相對豐度關系進行冗余分析（RAD），并采用LDA Effect Size（LEfSe）分析方法找到組間在豐度上有顯著差異的物種[25]。

2 結果與分析

2.1 各栽培區域油茶根際微生物群落結構特征

2.1.1 各栽培區域油茶根際土壤的養分特征

3個栽培區域均位于湖南省內，雖然氣候條件相似，但其土壤養分條件存在顯著差異（表1）。路口鎮油茶林地土壤pH為5.067，有機質、全氮、硝態氮及速效磷的含量顯著高于其他樣地。

表1 各栽培區域油茶根際土壤的養分特征?Table 1 Nutrients characteristics of C.oleifera rhizosphere in each cultivation area

2.1.2 各栽培區域油茶根際微生物群落的多樣性指數

各栽培區域油茶根際微生物群落的多樣性指數如圖1所示。由圖1可以看出，長沙市路口鎮林場油茶林地土壤細菌的豐富度和均勻度均最高，但真菌的豐富度和均勻度最低；邵陽縣七里山場油茶林地土壤真菌的豐富度和均勻度顯著高于其他樣地。

圖1 各栽培區域油茶根際微生物群落的多樣性指數Fig.1 The Diversity indexes of rhizosphere microbial communities of C.oleifera in each cultivation area

2.1.3 各栽培區域油茶根際微生物群落的結構

不同地理環境下油茶根際微生物群落的結構存在顯著差異，除了共有的優勢菌門外，邵陽縣七里山場油茶根際土壤中AD3菌門占比較高。各樣地中共有細菌OTU數量為289個，其中85.12%屬于變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門；共有的真菌OTU數量為89，其中74.10%屬于子囊菌門。共有細菌菌群中占比排在前20位的菌群有變形菌門的α變形菌綱紅螺菌目Rhodospirillales、黃單胞菌目Xanthomonadales、黃色桿菌科Xanthobacteraceae、醋桿菌科Acetobacteraceae、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、不動桿菌屬Acidibacter、 根霉菌屬Rhizomicrobium、 鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia、Reyranella屬、纖維堆囊菌屬Sorangium，綠彎菌門的JG37-AG-4菌綱、纖線桿菌目Ktedonobacterales，酸桿菌門的Subgroup_1和Subgroup_2菌綱、酸桿菌Subgroup_1菌科Acidobacteriaceae，放線菌門的蓋勒氏菌目Gaiellales，擬桿菌門的鹽堿厭氧菌目Halanaerobiales、熱酸菌屬Acidothermus，芽單胞菌門的芽單胞菌科Gemmatimonadaceae。共有且在真菌菌群中占比排在前10位的菌群為子囊菌門的古根菌Archaeorhizomycessp.、藤黃鐮刀菌Fusarium guttiforme、織球殼菌Plectosphaerella cucumerina、Penicillium terrigenum、Coniosporiumsp.、黑酵母菌Herpotrichiellaceaesp.、無絨毛青霉菌Penicillium laeve、杜鵑花類菌根真菌Oidiodendron maius、淡紫擬青霉Purpureocillium lilacinum，擔子菌門的糙孢菌Trechispora_sp.。

2.1.4 各栽培區域土壤因子對油茶根際微生物群落結構的影響

各栽培區域土壤因子對油茶林土壤中細菌群落結構影響的冗余分析結果如圖2所示。由圖2可以看出，3個地理區域內油茶根際土壤中微生物群落的分布存在顯著差異，其中土壤中銨態氮和全鉀含量對細菌群落結構的影響最為顯著，全氮和速效磷含量對真菌群落結構的影響最為顯著。

圖2 各栽培區域土壤因子對油茶根際微生物群落結構影響的冗余分析（RAD）結果Fig.2 Redundancy analysis (RAD) result of the effect of soil factors on C.oleifera rhizosphere bacterial community structure in each cultivation area

2.2 同一栽培區域各油茶良種根際微生物群落結構特征

2.2.1 同一栽培區域各油茶良種根際微生物群落的多樣性指數

長沙市路口鎮林場各油茶良種根際微生物群落的多樣性指數如圖3所示。由圖3可以看出，同一栽培區域不同油茶良種根際微生物的群落均勻度存在顯著差異，細菌群落的豐富度差異顯著，但真菌群落豐富度差異不顯著。XL1根際土壤中細菌OTU總量、細菌群落物種豐富度及均勻度均最高，XL64根際土壤中真菌OTU總量、真菌群落物種豐富度及均勻度指數最高。

圖3 長沙市路口鎮林場各油茶良種根際微生物群落的多樣性指數Fig.3 Diversity indexes of rhizosphere microbial community of different C.oleifera varieties in Lukou town forest farm of Changsha City

2.2.2 同一栽培區域各油茶良種根際微生物群落的結構

在同一栽培區域所有油茶良種根際微生物群落中，共有的細菌OTU比例為39.2%，共有的真菌OTU比例為46.1%。長沙市路口鎮林場各油茶良種根際細菌群落門水平的結構如圖4所示。由圖4可以看出，構成不同油茶良種根際細菌群落占比排在前10位的菌門相同，優勢菌門均為變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria和綠彎菌門Chloroflexi，群落結構中除優勢菌門占比略有差異外，其他主要菌門的占比差異不顯著。構成不同良種油茶林根際真菌群落的優勢真菌均為子囊菌門Ascomycotap，且子囊菌門Ascomycotap和擔子菌門Basidiomycotap的總和均占真菌群落總量的95%以上。

圖4 長沙市路口鎮林場各油茶良種根際細菌群落門水平的結構Fig.4 Community structure of rhizosphere bacterial phylum of different C.oleifera varieties in Lukou town forest farm of Changsha City

2.3 同一栽培區域不同撫育管理條件下油茶根際微生物群落結構特征

同一栽培區域的撫育人工油茶林與未撫育油茶林樣地的根際細菌、真菌的OTU總量均無顯著差異，但多樣性指數存在顯著差異。未撫育油茶林根際細菌和真菌群落的菌種豐富度指數較高，但撫育人工油茶林根際的真菌群落均勻度指數較高。邵陽縣七里山場不同撫育管理條件下油茶根際微生物群落門水平的結構如圖5所示。由圖5可以看出，撫育人工林根際土壤中綠彎菌門為細菌優勢菌群，占比約為55.72%，子囊菌門為真菌優勢菌門，占比為57.77%。未撫育油茶林根際土壤中，酸桿菌門為細菌優勢菌群，占比為35.81%，子囊菌門為真菌優勢菌門，占比為48.86%。除優勢菌群外，撫育人工油茶林與未撫育油茶林樣地的根際細菌群落中疣微菌門Verrucomicrobia差異最為顯著，在未撫育油茶林根際中占比顯著高于撫育人工油茶林。

圖5 邵陽縣七里山場不同撫育管理條件下油茶根際微生物群落門水平的結構Fig.5 Rhizosphere community structure in phylum level under different tending management measures in Qilishan farm of Shaoyang County

2.4 油茶根際共有微生物群落的結構特征

雖然立地條件、油茶良種以及撫育管理措施均對油茶根際微生物群落結構產生影響，但在各種影響因素下油茶根際仍存在共有微生物群落。采用spearman檢驗方法，選取所有樣本絕對豐度排在前20位的共有細菌OTU與門水平注釋結果相互關聯，結果如圖6所示。圖6中圓點的大小代表OTU豐度，線的粗細代表相關性。

由圖6可以看出，油茶根際共有的主要細菌菌群包含6個酸桿菌門Acidobacteria酸桿菌科的第1亞 群Acidobacteriaceae Subgroup 1（OTU8、OTU10、OTU14、OTU35、OTU53、OTU98），3個酸桿菌門的第2亞綱Acidobacteria Subgroup 2（OTU1、OTU5、OTU9），1個酸桿菌門索利氏菌科solibacteraceae的Candidatussolibacter屬（OTU41），5個綠彎菌門Chloroflexi的JG37-AG-4綱（OTU7、OTU12、OTU13、OTU3、OTU2788），1個綠彎菌門纖線桿菌目Ktedonobacterales的HSB_OF53-F07科（OTU16），1個變形菌門Proteobacteria的黃色桿菌科Xanthobacteraceae（OTU37），1個 變形菌門Xanthomonadales_Incertae_Sedis科的不動桿菌屬Acidibacter（OTU18），1個變形菌門慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium（OTU6），1個放線菌門的酸熱菌科Acidothermaceae的酸熱菌屬Acidothermus（OTU45）。油茶根際真菌群落中子囊菌屬Archaeorhizomyces的豐度值顯著高于其他菌群，為絕對優勢菌群，革菌科下革菌Thelephora-Tomentella（OTU11）與其他10個菌群均存在顯著的正相關關系，為主要的伴生、促生菌群。

圖6 油茶根際微生物群落的共線網絡Fig.6 Bacterial community structure co-occurrence network

3 結論與討論

本研究結果表明，不同栽培區域的油茶根際土壤養分特征和微生物群落結構存在差異。土壤中銨態氮含量和全鉀含量對細菌群落結構的影響最為顯著，這可能是不同栽培區域的油茶根際微生物群落結構存在差異的主要原因。金章利等[26]在山地草地的土壤研究中發現土壤微生物群落多樣性與土壤養分含量呈正相關。大量研究結果表明，土壤中養分的高度可利用性是造成土壤微生物生物量增加的主要因素[27-28]。但本研究中所選擇的栽培區域較少，為了探明不同栽培區域油茶根際土壤微生物群落結構的差異，后續將對湖南省內具有代表性的栽培區域開展持續性調查研究。

XL1號等4個油茶主栽品種栽培10年后油茶林根際細菌群落豐富度的差異較為顯著，但真菌群落豐富度差異不顯著。Nicole等[29]采用基因芯片技術分析了3個馬鈴薯品種的根際微生物群落結構，發現4%～9%的OTU相對豐度變化與植物宿主品種相關，其中，鏈霉菌科Streptomycetaceae表現出強烈的宿主相關性。Peiffer等[8]的研究結果表明，27種攜帶不同母本基因的玉米根際具有不同的微生物群落結構。轉基因土豆Solanum tuberosum和水稻Oryza sativa具有與母本植物不同的根圈微生物群落結構[30-32]。本研究結果表明，在未進行撫育管理的油茶林中，油茶根際細菌和真菌的菌種豐富度指數均較高，且除優勢菌群外，疣微菌門Verrucomicrobia群落差異最為顯著。未撫育管理的油茶林中雖然土壤養分含量較低，但因為油茶生長周期長且林分無人為擾動，微生物的群落結構相對豐富，寡營養型細菌生長良好。疣微菌門是一種寡營養型細菌，具有固氮作用和反硝化作用，在油茶的氮循環中起重要作用[32]。

植物對土壤微生物群落和功能有極為重要的生物化學影響。植物在整個生命周期（生長期和凋亡期）不斷向其立地土壤輸入植物源有機物（根際沉積和凋落物），為土壤微生物提供了豐富的碳源和營養物質，對土壤微生物群落組成和功能產生巨大影響，這也是根際土壤微生物群落結構和功能具有植物群落特異性假設的基礎[33-36]。本研究結果表明油茶存在特異性的根際微生物群落，其主要組成為酸桿菌門的酸桿菌科、索利氏菌科Candidatussolibacter屬等，綠彎菌門的JG37-AG-4綱、纖線桿菌目等，變形菌門的黃色桿菌科、不動桿菌屬、慢生型大豆根瘤菌等，放線菌門的酸熱菌屬等，子囊菌門的子囊菌屬，擔子菌門的革菌科下革菌等。根據基于微生物絕對豐度提出的植物根際微生物群落“擴增-選擇”組裝的新模型[37]，認為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是根際富集的主要菌群，酸桿菌門是根際排斥的主要菌群，放線菌門、γ-變形菌門及Δ-變形菌門從根際土進入根內的比例最大。在后續研究中將進一步驗證酸桿菌門由于相對豐度和絕對豐度引起的根系富集或排斥的結論。革菌科下革菌為重要的植物外生菌根真菌，油茶的菌根真菌以外生菌根為主，所以后續的菌肥研究中將注重革菌科下革菌的分離、培養及應用等。