外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理和品質的影響

高 文，花 蕊，郁萬文

（南京林業大學 南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037）

銀杏葉中類黃酮有調節血脂、抗氧化、抗炎癥、增強機體免疫等作用[1]，具有重要的藥用價值[2]。研究銀杏葉中黃酮積累的影響因素，對葉用銀杏的選育和栽培管理有重要的指導意義。植物體內黃酮類化合物合成代謝的起初源為光合產物[3]，有效光合作用有利于銀杏葉片中黃酮的積累[4]。氮素是植物需求量最大的礦質元素，植物根系吸收的無機態氮素有硝態氮和銨態氮，其中硝態氮是植物利用的主要氮素形態，在水淹地或還原性較強的土壤中，銨態氮是主要氮素形態[5-6]。氮素的吸收積累會影響植物的生長發育[7]，直接或間接影響植物體內的光合作用[8]，進而影響黃酮的合成積累。低氮促進了類黃酮物質的積累，高氮則抑制類黃酮物質的合成，但在不同植物中不同類黃酮物質的變化并不相同[9]。前人研究結果表明，在銀杏葉片生長后期施用氮肥將降低葉黃酮含量[10]，但有關該時期增施不同形態氮肥對葉黃酮含量影響的研究鮮見報道。本研究中通過分析銀杏葉生長、生理指標對不同外施銨態氮水平的響應，以及不同外施銨態氮水平處理下葉黃酮含量的變化，研究外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理及葉品質的影響及其生理機制，以期闡明銨態氮通過影響光合作用進而影響葉黃酮積累的生理過程，為葉用銀杏的氮肥管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年在南京林業大學白馬基地（119°19′E，31°61′N）進行試驗。以未經施肥處理的2年生半同胞家系銀杏幼苗為試材。試驗用聚乙烯塑料盆上口徑30 cm，下口徑25 cm，高27 cm，底部帶孔，盆下配有托盤防止養分流失。栽培基質為黃壤土，土壤理化性質為全氮含量5.454 g/kg，全磷含量0.952 g/kg，全鉀含量10.865 g/kg，銨態氮含量3.002 mg/kg，硝態氮含量6.129 mg/kg，pH 6.45。

1月選擇長勢均一、無病蟲害銀杏苗移栽于塑料盆中，每盆裝10 kg黃壤土。銀杏苗栽植后，置于通風良好的遮雨棚內進行緩苗，常規管理4個月左右，5月中旬轉移到溫室大棚內，適應1周后進行施肥試驗。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機區組設計。結合銀杏生長中的實際需氮特點，配制的氮肥設置4個銨態氮水平，每盆的總氮量分別為0 g（CK）、1 g（NH1）、2 g（NH2）、4 g（NH4），銨態氮（NH4+-N）均由分析純(NH4)2SO4提供，其他元素含量均相同。每個處理重復4次，每重復15株。除氮素形態配比處理外，所有盆栽苗隨機擺放，互不遮擋。2020年5月25日傍晚，采取一次性施肥處理，將各處理每盆所需要肥料使用分析天平稱量并溶解于300 mL蒸餾水中，依次澆入盆土中。整個試驗過程中進行定期定量澆水及除草常規管理等。

陳再興等[11]經研究發現，銀杏葉片總黃酮含量、總黃酮醇苷含量、萜類內酯含量分別在8、5、6月最高，葉片最佳采收期應在5—8月。丁銀花等[12]也認為6—8月采收銀杏葉較為合適。因此，本試驗中于8月25日9:00—10:00，隨機采集幼苗中部功能葉片，對銀杏葉片生長、生理和品質指標進行測定和評價。

1.3 指標測定

1.3.1 葉性狀指標

每個重復隨機取5株，按照上、中、下部位，各選取3片葉測定單葉干質量和單葉面積，計算比葉干質量（單葉干質量和單葉面積的比值）。

1.3.2 葉生理指標

采用無水乙醇提取法提取葉綠素[13]，測定提取液在470、474、485、645 nm波長下的吸光值，計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素的含量[14]。硝酸還原酶（NR）活性采用雙抗體夾心法測定。硝態氮（NO3－-N）、銨態氮含量采用紫外分光法測定[15]。N含量采用凱式定氮法測定，P含量采用鉬銻抗比色法測定，K含量采用火焰光度法測定[16]。

1.3.3 葉黃酮含量

參照文獻[17]中的方法并略有改動，對銀杏葉片黃酮醇苷類成分（槲皮素、山奈酚和異鼠李素[18]）的含量進行測定。以C18柱為色譜柱，以甲醇與0.4%磷酸的混合溶液（體積比50∶65）為流動相；檢測波長360 nm，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定槲皮素含量（C槲皮素）、山奈酚含量（C山奈酚）和異鼠李素含量（C異鼠李素），按下式換算成總黃酮含量（C總黃酮）：

C總黃酮=(C槲皮素+C山奈酚+C異鼠李素)×2.51。

1.4 數據分析

使用Excel 2016、SPSS 25.0軟件進行數據處理和統計分析，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較，采用Spearman方法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 外施銨態氮水平對銀杏葉各生長指標的影響

外施銨態氮水平對銀杏葉片各生長指標的影響如圖1所示。由圖1可見，外施銨態氮水平對銀杏單葉干質量、單葉面積和比葉面積有顯著影響（P＜0.05），單葉干質量、單葉面積、比葉干質量均隨外施銨態氮水平的上升呈單峰趨勢，NH2處理時達到最高值，較CK分別顯著提高了36.38%、27.94%、6.52%。這表明適宜的外施銨態氮水平對銀杏葉片的生長有促進作用。

圖1 不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片各生長指標Fig.1 Growth indexes of G.biloba leaves under different levels of ammonium nitrogen

2.2 外施銨態氮水平對銀杏葉各生理指標的影響

2.2.1 對光合色素含量的影響

葉綠素是葉片進行光合作用的主要物質基礎，其含量可作為反映植物光合作用能力的重要指標[19]，葉綠素含量下降表明葉片開始衰老[20]。8月，不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片光合色素含量如圖2所示。由圖2可見，外施銨態氮水平顯著影響銀杏葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素的含量（P＜0.05），隨外施銨態氮水平的升高均呈單峰趨勢，在NH2處理時達到峰值，并與其他處理有顯著差異，但其他處理間無顯著差異。這表明適宜的外施銨態氮水平能顯著提高銀杏葉片的光合色素含量，延緩葉片衰老。

圖2 不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片光合色素含量Fig.2 Photosynthetic pigment content of G.biloba leaves under different ammonium nitrogen levels

2.2.2 對硝態氮、銨態氮含量及硝酸還原酶活性的影響

硝態氮在硝酸還原酶、亞硝酸還原酶（NIR）作用下轉變為銨態氮，銨態氮再循環轉變為可被植物直接利用的有機態氮[21]。8月，不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片硝態氮、銨態氮含量及硝酸還原酶活性如圖3所示。由圖3可見，外施銨態氮水平顯著影響了銀杏葉片的硝酸還原酶活性（P＜0.05）。CK處理下，銀杏葉片硝酸還原酶活性顯著高于其他處理，且隨著外施銨態氮水平的升高，硝酸還原酶活性下降。不同處理下，銀杏葉片銨態氮含量和硝態氮含量的差異顯著（P＜0.05），且隨外施銨態氮水平的升高，銨態氮和硝態氮的含量均顯著升高，NH4處理較CK處理顯著增長了166.10%、24.67%。CK處理下，葉片硝態氮含量高于銨態氮含量，其余處理下，葉片硝態氮含量低于銨態氮。

圖3 不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片硝態氮、銨態氮含量及硝酸還原酶活性Fig.3 Nitrate nitrogen, ammonium nitrogen content and nitrate reductase activity of G.biloba leaves under different external ammonium nitrogen levels

可見，施用銨態氮提高了銀杏葉片銨態氮的含量，使銨態氮含量與硝態氮含量的比例增高，但施用銨態氮使硝酸還原酶活性降低，引起硝態氮的還原性減弱[22]，因而硝態氮含量升高。

2.2.3 對氮磷鉀含量的影響

不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片氮磷鉀含量如圖4所示。由圖4可見，外施銨態氮水平顯著影響了銀杏葉片氮、磷的積累量（P＜0.05），對鉀的積累量影響不顯著（P＞0.05）。隨外施銨態氮水平的升高，銀杏葉片氮含量顯著升高，NH4處理中葉片氮含量較CK處理顯著提高了25.09%；NH2處理下，銀杏葉片磷含量最高，顯著高于其他處理；銀杏葉片鉀含量呈單峰趨勢，NH2處理時達到峰值?？梢?，施入銨態氮顯著促進了銀杏葉中氮、磷的積累，同樣促進了鉀的積累，但影響不顯著。

圖4 不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉片氮磷鉀含量Fig.4 Contents of NPK in G.biloba leaves under different levels of ammonium nitrogen

2.3 外施銨態氮水平對銀杏葉黃酮含量的影響

8月，不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉黃酮含量如圖5所示。由圖5可見，外施銨態氮水平顯著影響銀杏葉片的黃酮醇苷類成分和總黃酮含量（P＜0.05），槲皮素、山奈酚含量均隨外施銨態氮水平呈逐漸上升的趨勢，且均在NH4處理達到峰值。異鼠李素含量隨外施銨態氮水平升高呈先上升、再下降的趨勢，在NH2處理時最高，較CK處理增加10.20%。銀杏葉片的總黃酮含量隨外施銨態氮水平升高呈先下降、再上升的趨勢，在NH4處理時最高，較CK處理增加28.54%。

圖5 不同外施銨態氮水平處理下銀杏葉黃酮含量Fig.5 Flavonoid content of G.biloba leaves under different ammonium nitrogen levels

可見，8月，施入適宜水平的銨態氮能顯著提高銀杏葉片的黃酮醇苷類成分和總黃酮的含量，施入過高或過低水平的銨態氮均會使異鼠李素含量顯著降低。

2.4 銀杏葉片黃酮含量與其生長及生理指標的相關性

對銀杏葉片黃酮含量指標（槲皮素含量、山奈酚含量、異鼠李素含量、總黃酮含量）與其生長及生理指標（單葉干質量、單葉面積、比葉干質量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、總葉綠素含量、硝酸還原酶活性、硝態氮含量、銨態氮含量、N含量、P含量、K含量）的相關性進行分析，結果見表1。

由表1可知，黃酮醇苷類成分及總黃酮的含量與單葉干質量、單葉面積、比葉干質量、K含量及總葉綠素含量均無顯著相關性，槲皮素含量與葉綠素a、類胡蘿卜素含量呈顯著或極顯著負相關（P＜0.05或P＜0.01），與硝態氮、銨態氮含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；山奈酚含量與硝態氮、銨態氮、N含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。異鼠李素含量與葉綠素b含量、硝酸還原酶活性、P含量呈顯著或極顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01）；總黃酮含量與類胡蘿卜素含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與硝態氮、銨態氮含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。

表1 銀杏葉片黃酮含量與其生長及生理指標的相關系數?Table 1 Correlation coefficient between flavonoids content in G.biloba leaves and their growth and physiological indexes

由此說明，除單葉干質量、單葉面積、比葉干質量、K含量、總葉綠素含量外，其他生理指標均與總黃酮及黃酮醇苷類成分含量存在相關關系。

2.5 外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理和品質影響的綜合評價

因各指標在不同處理間的變化趨勢不一致，為了更好地評價外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理和品質的影響，篩選出適用于葉用銀杏栽培的外施銨態氮水平，將測定的17個指標進行主成分分析，結果見表2。由表2可知，第1主成分的特征值為8.641，方差貢獻率為50.828%；第2主成分的特征值為6.536，方差貢獻率為38.446%；第3主成分的特征值為1.824，方差貢獻率為10.727%。前3個主成分的累計貢獻率達到100%（＞85%），表明前3個主成分代表了17個指標100%的綜合信息，因此，前3個主成分可以較好反映所測定17個指標的相對重要性和各指標間的關系。

表2 外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理和品質影響的主成分荷載矩陣及方差貢獻率Table 2 Principal component load matrix and variance contribution rate of the effects of external ammonium nitrogen levels on the growth,physiology and quality of G.biloba leaves

以X1、X2、X3……X17分別代表單葉干質量、單葉面積、比葉干質量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、總葉綠素含量、硝酸還原酶活性、銨態氮含量、硝態氮含量、氮含量、磷含量、鉀含量、槲皮素含量、山奈酚含量、異鼠李素含量、總黃酮含量等指標原始數據的標準化值，以F1、F2、F3分別代表第1、2、3主成分的得分，根據特征向量矩陣得到各主成分得分的線性方程：

F1=0.936X1+0.907X2+0.922X3+0.980X4+0.977X5+0.928X6+0.979X7-0.422X8+0.237X9+0.298X10+0.315X11+0.798X12+0.994X13-0.266X14-0.117X15+0.444X16-0.165X17；

F2=0.269X1+0.377X2-0.077X3-0.189X4-0.212X5-0.229X6-0.194X7-0.806X8+0.970X9+0.942X10+0.946X11-0.302X12+0.065X13+0.828X14+0.981X15-0.495X16+0.885X17；

F3=-0.225X1-0.188X2-0.378X3+0.069X4+0.031X5+0.295X6+0.060X7+0.415X8+0.050X9+0.154X10-0.075X11+0.521X12-0.085X13+0.494X14+0.154X15+0.747X16+0.436X17。

根據上述線性方程分別計算各主成分的得分，以每個主成分的貢獻率作為權重，計算各處理的綜合得分。3個主成分的權重值分別為50.828%、38.446%、10.727%，綜合得分計算公式為F=50.828%F1+38.446%F2+10.727%F3。外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理和品質影響的綜合評價結果見表3。由表3可知，各外施銨態氮水平處理對銀杏葉生長、生理、品質影響的綜合得分由大到小依次為NH2、NH4、NH1、CK，說明外施銨態氮水平能有效調控銀杏葉片的生長、生理和品質，外施銨態氮水平為2 g/盆時銀杏葉的綜合表現更佳。

表3外施銨態氮水平對銀杏葉生長、生理和品質影響的綜合評價結果?Table 3 Comprehensive evaluation of effects of ammonium nitrogen level on growth, physiology and quality of G.biloba leaves

3 結論與討論

氮元素是木本植物生長發育所需的大量元素之一，氮的供給水平影響了木本植物生長發育的許多生理過程。吳家勝等[23]的研究結果表明，氮的增施對銀杏葉產量、單葉面積及單葉質量等均有良好的促進作用，每株3 g為最佳施氮量。銨態氮和硝態氮均可為植物的生長發育提供充足的氮源[24]。本研究結果表明，施加適宜水平的銨態氮可顯著提高銀杏單葉面積、單葉干質量和比葉干質量，促進銀杏葉片生長，且各生長指標均在每盆施氮量為2 g時達到最高值。

光合作用是植物重要的生理過程，是植物生長發育的基礎。前人經研究發現，氮素可以通過影響傳導CO2的能力調控光合速率[25]，施氮可降低光合底物傳輸過程中的非氣孔限制，提高葉片的光合能力，延長高光合持續期[26]。氮素還可以通過影響植物葉片含氮量直接影響植物的光合作用[27]。氮素是葉綠素的主要構成元素，施加氮素可以促進葉綠素的合成[28]。本研究結果表明，施入適宜水平的銨態氮能提高銀杏葉的光合色素含量，延緩葉片衰老，最佳外施銨態氮水平為每盆2 g，過多則會抑制光合色素的合成代謝。葉綠素含量可作為反映植物光合作用能力的重要指標[19]，施入適宜水平的銨態氮可提高銀杏葉片的光合能力，這與吳楚等[29]的研究結果一致。銨態氮能抑制植物對硝態氮的吸收[29]，降低硝酸還原酶活性[30]。本研究結果表明，施加適量銨態氮能提高植物體內銨態氮水平，降低硝酸還原酶活性，使硝態氮的還原性減弱，導致硝態氮含量上升，進而增加植物體內氮含量。提高葉片氮含量能夠提高植物葉片的光合效能[28]，同樣驗證了施入適宜水平的銨態氮提高了銀杏葉片的光合效能。施入適量的銨態氮同樣促進了銀杏葉片磷、鉀的積累，但對鉀含量的影響不顯著。葉片中氮、磷、鉀、鐵、鎂等營養元素會對光合生理過程產生直接影響[31]。

氮肥是影響植物黃酮類物質含量的重要因素。Larbat等[32]的研究結果表明，低氮脅迫增加了番茄根、莖、葉中黃酮的含量；Strissel等[33]的研究結果表明，大量施氮降低了蘋果葉片中類黃酮物質的含量。低氮促進植物黃酮類物質積累，高氮抑制黃酮類物質合成，但在不同的植物中具體變化不相同[8]。在對銀杏的研究中，吳家勝等[23]的研究結果表明，適宜的施氮量可以提高銀杏苗木葉片的黃酮總量，缺氮或施氮過量均不利于葉片黃酮的積累，1.5 g/株施氮量的處理中葉片各黃酮類物質含量和黃酮總量最大。本研究結果表明，在銀杏生長高峰期（5月下旬）施加適當水平的銨態氮能顯著提高銀杏葉片黃酮類物質的含量，這與前人的研究結果基本一致[34]。

植物的各種生理過程對其次生代謝產生影響[35-36]。相關性分析結果表明，總黃酮或黃酮醇苷類成分含量與葉綠素b含量、硝酸還原酶活性、硝態氮含量、銨態氮含量、氮含量、磷含量呈顯著正相關，說明隨著外施銨態氮水平的上升，銀杏葉片的葉綠素含量和營養元素氮、磷的積累增加，從而進一步提升銀杏葉黃酮的含量。采用主成分分析法提取3個主成分，進行綜合排名，結果表明每盆施入總氮量2 g處理的綜合得分最高，該處理能有效促進銀杏葉片的生長，提高銀杏葉片的銨態氮含量、硝態氮含量、氮磷鉀含量、硝酸還原酶活性等生理指標，并且顯著提高黃酮類物質含量。所以，在葉用銀杏的栽培管理中，適宜的銨態氮施肥水平為2 g/盆。

本研究中重點關注了銀杏苗葉片對外施銨態氮的生理響應，得出有利于銀杏生長發育及黃酮積累的適宜外施銨態氮水平。但當銨態氮為單一氮源時，植物需消耗大量能量進行氮素轉化，而硝態氮與之相反，可以減少能量消耗。硝態氮和銨態氮共同配合的情況下，植物的生長發育更好[25]。因而還應繼續探究適宜的外施硝態氮水平，并在此基礎上篩選適用于葉用銀杏的最優硝銨配比。