薄殼山核桃煤污病病害調查及病原菌鑒定

陳雅琦，莫正海，婁文睿，翟 敏，郭忠仁，宣繼萍

（江蘇省中國科學院植物研究所 a.江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室；b.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014）

薄殼山核桃Carya illinoinensis（Wangenh.）K.Koch又名美國山核桃、長山核桃，為胡桃科山核桃屬落葉大喬木，原產于美國和墨西哥北部，喜溫暖濕潤氣候，是優良的干果和木本油料樹種[1-3]。近年來，國內的薄殼山核桃產業發展較快，江蘇省內的南京、句容、泗洪等地已開始形成局部產業規模[4]。隨著薄殼山核桃種植面積的不斷擴大，危害薄殼山核桃的病害種類也不斷增多。目前，我國已見報道的薄殼山核桃病害共計21種，其中已查明病原的病害有17種，未查明病原的病害有4種，煤污病為4種未查明病原的病害之一[5]。

煤污病對薄殼山核桃的危害極大，薄殼山核桃感染煤污病后其葉片、枝條的表面會產生大量灰色至灰黑色霉點甚至霉層，使得葉片正常的光合作用受到阻礙，進而影響樹勢、果實產量及品質[6]。為了解薄殼山核桃煤污病的發病率、感病指數及其與品種間的關系，明確煤污病的致病病菌，本研究調查了6個不同的薄殼山核桃品種，統計并計算其煤污病的發病率及感病指數；并以‘斯圖爾特’染病葉片為病原菌提取材料，通過形態學觀察及rDNA-ITS序列分析對煤污病病原菌進行鑒定，并采用柯赫氏法則加以驗證，以期為薄殼山核桃抗煤污病品種的選擇與煤污病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 薄殼山核桃煤污病病害調查

1.1.1 調查地點及調查對象概況

調查地點位于南京市六合區雄州街道龍虎營村的試驗基地（118°53′17″E，32°18′24″N），為中緯度地區，屬北亞熱帶季風氣候區，四季分明，雨水充沛。1月的平均氣溫為2.2 ℃，7月的平均氣溫為27.9 ℃。

基地內種植的薄殼山核桃品種分別為‘波尼’‘金華’‘馬罕’‘斯圖爾特’‘紹興’‘威奇塔’，于2013年春定植，種植密度為4 m×8 m。

1.1.2 煤污病病害的調查

每個薄殼山核桃品種隨機調查3株，選取各樣株樹冠范圍內離地面0～2 m高的小葉調查煤污病的發病狀況，按下式計算其發病率，參考方中達[7]所用的分級計數標準并結合實際情況制定薄殼山核桃煤污病病情分級標準（表1）。

表1 薄殼山核桃煤污病感病指數分級標準Table 1 Classification standard for sooty mold disease index of pecan

1.2 薄殼山核桃煤污病病原菌的分離與鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化

使用無菌挑針輕輕刮取病葉上的霉層，將適量霉層粉末置于裝有1 mL無菌水的離心管中，輕輕振蕩制成孢子懸浮液。用酒精燈灼燒接種環，待接種環冷卻后蘸取孢子懸浮液，在PDA平板表面連續劃線，于24 ℃的溫度條件下進行黑暗培養以獲得單菌落。挑取單菌落邊緣的菌絲，再將其轉移至新的PDA平板上培養以獲得純化菌株，并于25 ℃的溫度條件下進行黑暗培養，分別于黑暗培養7、14、28 d時觀察菌落的生長狀態。

1.2.2 病原菌的形態學鑒定

使用粘片法[8]對培養7、14或28 d后的病原菌分別進行形態學的鑒定：剪取小段透明膠，輕輕粘取菌絲或者孢子后將此小段透明膠置于滴有浮載劑的載玻片上，于顯微鏡下觀察病原菌菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形狀、顏色及大小。

1.2.3 病原菌的分子生物學鑒定

使用OMEGA真菌DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA，選取通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）對 真 菌DNA的ITS片段進行擴增。反應體系為：50 μL，包含1 μL的DNA模板，25 μL的2×TSINGKE Master Mix（Blue），引物ITS1及ITS4各取1 μL（10 μmol/L），無菌超純水22 μL。PCR的擴增程序為：首先在94 ℃的條件下進行5 min的預變性；然后在94 ℃的條件下變性30 s，在58 ℃的條件下退火30 s，在72 ℃的條件下延伸30 s，共計35個循環；最后在72 ℃的條件下進行10 min的終延伸。將PCR產物置于1%的瓊脂糖中進行凝膠電泳檢測，回收目的片段，然后將回收到的目的片段送往南京擎科生物科技有限公司進行測序。將測序所獲得的序列置于NCBI網站中進行同源性Blast比對，隨后下載相關真菌的ITS序列，再使用ClustalX 1.81軟件進行多序列比對，采用MEGA X軟件內置的鄰位連接法（Neighbor-Joining Method，NJ）[9]進行系統發育樹的構建（No.of Bootstrap Replications參數設為1 000，其余參數均為默認）。

1.2.4 病原菌致病性的驗證

選擇薄殼山核桃幼苗上的健康葉片為接種材料，使用無菌水清洗葉片后，將孢子懸浮液涂抹在葉片表面上[7]，以清洗后涂抹無菌水的葉片作為對照，在溫度為25 ℃、濕度為95%的條件下進行12 h光照/12 h黑暗的交替培養。霉斑形成后，從接種部位再次分離病原菌，進行形態學及分子生物學鑒定，觀察其是否與原接種病原菌相同。

2 結果與分析

2.1 薄殼山核桃不同品種的發病率和感病指數

薄殼山核桃煤污病主要發生在葉片和枝條上，不同病級的煤污病典型癥狀如圖1所示。從圖1中可以看出，感病指數最高的病級是V級。感染煤污病后葉片的上表面會形成黑色的霉層，而葉片的下表面并沒有受到煤污病的危害。6個薄殼山核桃品種的發病率和感病指數見表2。由表2可知，6個薄殼山核桃品種的發病率從高到低依次為：‘紹興’（66.79%）、‘斯圖爾特’（61.98%）、‘威奇塔’（54.08%）、‘金華’（48.79%）、‘馬罕’（27.17%）和‘波尼’（24.13%）。6個品種中，煤污病感病指數最高的是‘斯圖爾特’，其感病指數為39.35；其次依次是‘紹興’‘威奇塔’‘金華’，其感病指數分別為32.34、24.23、21.82；‘馬罕’和‘波尼’的感病指數均較低，分別為14.12與11.07。調查數據顯示，‘紹興’的發病率最高，而其發病的嚴重程度稍低；‘斯圖爾特’的發病率不如‘紹興’，但其嚴重程度比‘紹興’的高，且為6個品種中的最高者；‘威奇塔’‘金華’‘馬罕’‘波尼’的發病率與感病指數的排名均一致。綜合而言，‘斯圖爾特’和‘紹興’遭受煤污病危害的程度均較重，均為重度受害品種（其中，‘斯圖爾特’的受害程度最大），‘威奇塔’和‘金華’均為中等受害品種，‘馬罕’和‘波尼’為輕度受害品種。

表2 6個薄殼山核桃品種的發病率和感病指數?Table 2 Incidence and disease index of six pecan cultivars

圖1 不同病級的薄殼山核桃煤污病的發病癥狀Fig.1 Symptoms of pecan sooty mold in different disease grades

2.2 薄殼山核桃煤污病病原菌的分離與鑒定結果

2.2.1 薄殼山核桃煤污病菌的形態學鑒定結果

經過多次分離純化及顯微觀察，初步篩選得到了3種不同的煤污病菌，分別編號為B04、F03和G07，其在PDA培養基上的菌落形態如圖2所示，3種煤污病病原菌的顯微結構如圖3所示。

觀察發現，菌株B04在培養基上生長14 d后其菌落直徑約為6 cm。從圖2A中可以看出，菌落正面呈絨狀，橄欖綠至深灰綠色，邊緣菌絲白色，可見同心圓輪紋；菌落背面，綠褐色至墨綠色，邊緣白色。顯微鏡下觀察發現，該真菌分生孢子梗單生，直立，側生或頂生，常具有隔膜，分隔處不收縮，淡褐色，光滑，具孢痕；分枝分生孢子呈圓柱形，無隔膜或具有1個隔膜，分枝分生孢子的大小為（12～23）×（3～4）μm；分生孢子多鏈生于分枝分生孢子頂部，橢圓形或檸檬形，分生孢子的大小通常為（3.5～8.0）×（2.5～4.0）μm（圖3A）。該菌落的形態與有關文獻[10-12]描述的枝孢屬Cladosporium真菌的形態相似，據此可初步鑒定其為枝孢屬某真菌。

圖2 PDA培養基上3種煤污病病原菌的菌落形態Fig.2 Colony morphology of three pathogens of sooty mold on PDA

圖3 3種煤污病病原菌的顯微結構Fig.3 Microstructure of three pathogens of sooty mold

菌株F03在培養基上初為臟白色，菌落光滑粘稠，生長7 d后，其菌落直徑還不到3 cm。菌落表面平展，呈油漆狀，墨綠色至黑色，邊緣呈根狀（圖2B）。顯微鏡下觀察發現，該真菌菌絲深褐色，常斷裂成小段，單個細胞呈磚型形，寬5.5～7.0 μm；分生孢子梗不明顯；孢子透明、淡綠至深褐色，形態各異，單孢橢圓形，光滑，常為深褐色，單孢大小為（5.5～8.5）×（2.5～4.5）μm；雙孢常呈葫蘆形，兩端鈍圓，光滑，淡綠至深褐色，雙孢的尺寸為（8.5～16）×（5.5～7.5）μm（圖3B）。菌株F03的形態與有關文獻[13-14]描述的短梗霉屬Aureobacidium真菌的形態相似，據此可初步鑒定其為短梗霉屬真菌。

菌株G07生長緩慢，培養基上生長28 d后其菌落直徑還不到2 cm。菌落表面褶皺，中部隆起，深褐色至黑色，可見少量菌絲（圖2C）。顯微鏡下觀察發現，該真菌菌絲呈褐色，常由多根菌絲組合成束狀而生長；分生孢子單生，褐色，光滑，具有分生孢子臂，使得整個孢子呈星狀；分生孢子臂著生的基部細胞直徑為2～3 μm，單個分生孢子具有3～4個分生孢子臂；每個分生孢子臂具有2～3個隔膜，隔膜處稍收縮，整臂長為16～20 μm，上窄下寬，近圓錐形，基部寬為6～7 μm，頂端寬為1～3 μm（圖3C）。菌株G07的形態與有關文獻[15-16]描述的多臂菌屬Trichomerium真菌的形態相似，據此可初步鑒定其為多臂菌屬真菌。

2.2.2 薄殼山核桃煤污病菌的分子生物學鑒定結果

提取病原菌核基因組DNA后，采用ITS1/ITS4引物進行ITS片段的PCR擴增。將純化回收后的目的片段進行測序，然后利用NCBI網站將測序結果進行Blast比對，下載相關序列并構建系統發育樹。分析結果表明，病原菌B04的ITS序列與枝狀枝孢C.cladosporioides（LC515108.1）的序列的相似性較高，以ITS序列構建系統發育樹，結果如圖4所示。由圖4可知，病原菌B04與枝狀枝孢C.cladosporioides可聚為一類。結合形態特征鑒定結果分析，可將煤污病菌株B04鑒定為枝狀枝孢C.cladosporioides。

圖4 菌株B04的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain B04

病原菌F03的ITS序列與出芽短梗霉A.pullulans的序列（DQ309591.1）的相似性較高，以ITS序列構建其系統發育樹，結果如圖5所示。由圖5可知，病原菌F03與出芽短梗霉A.pullulans可聚為一類。結合形態特征鑒定結果分析，可將煤污病菌株F03鑒定為出芽短梗霉A.pullulans。

圖5 菌株F03的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain F03

病原菌G07的ITS序列與薯蕷多臂菌T.dioscoreae的序列（NR137946.1）的相似性較高，以ITS序列構建其系統發育樹，結果如圖6所示。圖6表明，病原菌G07與薯蕷多臂菌T.dioscoreae可聚為一類。結合形態特征鑒定結果分析，可將煤污病菌株G07鑒定為薯蕷多臂菌T.dioscoreae。

圖6 菌株G07的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain G07

2.2.3 病原菌致病性的測定結果

為了驗證病原菌的致病性，本研究將純化的菌株B04、F03及G07分別接種至薄殼山核桃葉片上，接種后觀察發現，葉片表面形成灰黑色霉斑，且菌株B04形成霉斑的速度最快，其次依次是菌株F03與G07，而對照葉片未產生霉斑。觀察從發病部位重新分離培養得到的菌株發現，其與接種前所用純化菌株一致，這表明枝狀枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蕷多臂菌T.dioscoreae均可導致薄殼山核桃煤污病的發生。

3 討 論

煤污病病原菌的孢子或者菌絲體碎片通常借助雨水或氣流進行傳播。當孢子或者菌絲在含有蜜露的基質上萌發后，煤污病病原菌會在植株表面上生長。發病初期，植株體表可產生黑色煙煤狀物質或覆蓋絨毛狀物，隨后霉斑擴大并連接成片，最終形成霉層布滿整個葉片、嫩枝及果實；發病后期，部分由病原菌造成的煙煤狀物上會形成子囊殼、分生孢子器等結構，越冬后成為第2年的初侵染來源，并可造成多次的再侵染[6,17]。煤污病發病盛期分別為每年的3—6月和9—11月，其發病高峰期往往和蚜蟲、蚧殼蟲和粉虱等刺吸式害蟲的危害盛期一致[18]。有關大麥[19]、赤楠[20]、文冠果[21]等植物煤污病的研究結果均表明，煤污病的發生與蚜蟲相伴相生。蚜蟲在攝取植物汁液中的水分和可溶性碳水化合物的同時，分泌出大量的粘性蜜露附著在葉片表面，這些富含營養物質的蜜露成為霉菌的培養基，從而誘導煤污病的發生[22]。已有研究結果表明，在薄殼山核桃中，煤污病的發生同樣是由于蚜蟲分泌的蜜露造成的[23]。而蜜露不易附著于葉片的下表面，這可能是薄殼山核桃煤污病主要危害葉片上表面的原因。研究中發現，薄殼山核桃不同品種遭受煤污病危害的程度有所不同，其中一個很重要的原因可能是，不同品種的葉片表面形態結構存在差異[24]。‘斯圖爾特’與‘紹興’的葉片表面均較粗糙，這使得蜜露易附著在葉片表面上；而‘馬罕’與‘波尼’的葉片表面均較光滑，蜜露不易附著在葉片表面上。葉片附著蜜露能力的差異性可能導致了不同品種遭受煤污病危害的程度不同。

煤污病病原菌種類豐富，可以組成不同的群落致使植物發病，且不同地區主要流行的煤污病病原菌群落也存在差異。姜廣正等[25]調查發現：北京、天津、煙臺和南京地區的一些植物上煤污菌的群落組合均較簡單，僅限于出芽短梗霉A.pullulans、枝孢屬Cladosporium、鏈格孢屬Alternaria這3個種群；而杭州和青島等地區一些植物上煤污菌的群落組合不但比較復雜，而且出現了少見的種群，如麥提多綹孢Tripospermum mytti。研究中發現，薄殼山核桃煤污病病原菌由枝狀枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蕷多臂菌T.dioscoreae組成，其中的枝狀枝孢C.cladosporioides與出芽短梗霉A.pullulans均屬于南京地區常見的煤污病病原菌種群，而薯蕷多臂菌T.dioscoreae模式種是日本學者從薯蕷葉片上分離得到的[16]，在我國云南及陜西的芒果、山楂樹上均被發現，其可導致煤污病的發生[15]。目前，南京地區此前未有過該病原菌的相關報道，其原因可能是，該病原菌的存在可能與供試薄殼山核桃的生長環境有關（采樣地點位于南京六合區農村，地處靈巖山山腳下），人類的采集行為或者野生動物的活動使得病原菌的傳播范圍從山上擴大到山腳下，同時生長在薄殼山核桃附近的植物中也可能存在提供侵染來源的儲存寄主[15,26]。

枝狀枝孢C.cladosporioides是一種常見的腐生菌，具有單孢型的分生孢子梗，孢子梗不會膨大，產生孢子后也不再延長，其上產生的分枝分生孢子上又會產生體小而數量多的鏈狀分生孢子，在外力作用下極易分散，直接觀察材料時容易被忽略，但人工培養時則極易獲得[10,27]。觀察發現，該病原菌分離得到的孢子數量多，菌絲生長速度快，并且極易在葉片上形成霉斑，這種生長優勢可能是其成為薄殼山核桃煤污病主要致病菌的重要原因。

出芽短梗霉A.pullulans是一種類酵母真菌，不同的環境條件可導致其形態的改變，細胞常呈菌絲狀或酵母狀，可形成節孢子、芽分生孢子、厚垣孢子等[14]。出芽短梗霉A.pullulans的分布范圍廣，植物體、石灰巖及海洋中都可分離到此真菌，其具有很高的滲透壓耐受性，同時其分泌的胞外多糖具有黏性，使得該真菌極易黏附在物體表面上[28]。該真菌的易于附著于物體表面的特點，可能是導致薄殼山核桃煤污病發生的一個重要原因。周小燕等[27]認為，散播煙霉Fumago vagans是柑橘煤污病的優勢病原菌之一；而陸家云[13]與李榮禧等[29]則認為，煤污病病原菌之一的散播煙霉Fumago vagans實質上為出芽短梗霉A.pullulans、枝孢Cladosporiumspp.、鏈格孢Alternariasp.這三者或者前兩者的混合體。在對薄殼山核桃煤污病病原菌進行初步分離時發現，出芽短梗霉A.pullulans與枝狀枝孢C.cladosporioides常一起生長，這可能是由出芽短梗霉A.pullulans分泌的胞外多糖的物理黏附作用所致，而非代謝產物間的相互影響所致[25]。

多臂菌Trichomeriumspp.原屬于座囊菌綱Dothideomycetes煤炱目Capnodiales的真菌，后來被歸到散囊菌綱Eurotiomycetes刺盾炱目Chaetothyriales中[30]，該類真菌菌絲多分支，常勾連成束狀、網狀，在葉表面生長[15]，本研究中分離得到的薯蕷多臂菌T.dioscoreae在培養基上及葉片上生長的形態與該屬真菌菌絲的生長形態一致，其復雜立體的結構使得該病原菌不易被水流和氣流沖走，菌絲間的空隙為其它煤污病病原菌的附著及生長提供了有利的條件，從而導致病害的發生。

煤污病的分布范圍廣，危害的植物種類多，且菌落組成成分復雜，是一種常見的病害，而有關此病害的研究報道卻少。目前，有關煤污病的研究內容主要集中在病原菌的分離鑒定、危害及防治等方面。本研究分離鑒定了3種薄殼山核桃煤污病的病原菌，但對這3種病原菌的組成比例卻未作研究，不同品種的薄殼山核桃間其病原菌的組成比例是否有變化，對此問題仍待研究。薄殼山核桃在煤污病脅迫下其自身的生理生化變化及生長與抗病反應間的權衡，也是下一步研究的重點。

4 結 論

綜上所述，不同薄殼山核桃品種的發病率和感病指數存在差異，煤污病對‘斯圖爾特’和‘紹興’的危害最嚴重，對‘威奇塔’和‘金華’的危害程度中等，對‘馬罕’和‘波尼’的危害最輕。枝狀枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蕷多臂菌T.dioscoreae均可導致薄殼山核桃煤污病的發生。