Bacillus velezensis SWUJ1拮抗物質分離純化及抑菌機理研究

歐婷，金必堃，高海英，王若琳，張雨陽，左偉東，謝潔

西南大學 蠶桑紡織與生物質科學學院/家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715

目前，植物病害主要通過化學農藥進行防控，該方法雖然耗時短、見效快，但存在易導致環境污染、使植物病原菌產生抗藥性等問題[1-2]．因此，開發對環境綠色安全且能持久有效地防治植物病害的生物防控方法具有重要意義．其中，益生微生物制劑就是化學殺菌劑的良好替代品[3]．自1921年Hartely首次利用拮抗真菌防治Pythiumdebaryanum引起的猝倒病以來，部分益生真菌、放線菌和細菌等微生物被廣泛應用于生物防治[4-5]．芽孢桿菌是土壤和植物相關微生物的優勢種群，具有較好的抑制植物病原菌的能力，對環境無毒害作用，且其芽孢抗逆性強，被廣泛用于植物病害生物防治[6]．其中，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是2005年才被報道的一種新型生防菌種[7]．2016年Dunlap等[8]通過比較基因組學和insilicoDNA-DNA雜交手段，將甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)、解淀粉芽孢桿菌植物亞種(B.amyloliquefacienssubsp.plantarum)和稻生芽孢桿菌(B.oryzicola)歸類為貝萊斯芽孢桿菌．研究表明貝萊斯芽孢桿菌是極具應用潛力的生防細菌，Liu等[9]分離出的B.velezensisD4可以抑制蘋果樹腐爛病病原菌黑腐皮殼菌(Valsamali)的生長，分離自番茄根際土壤的B.velezensisY6菌株對植物病原菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)孢子萌發表現出較強的抑制作用[10]。

芽孢桿菌的抑菌機制主要包括拮抗作用、競爭作用和誘導植物抗性等[11]．拮抗作用是指微生物產生拮抗物質直接抑制或殺死另一種微生物．芽孢桿菌可產生脂肽類化合物、聚酮類化合物和抗菌蛋白等拮抗物質抑制病原菌生長[12]．其中，脂肽類化合物由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)途徑合成，而聚酮類化合物則是由聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)途徑合成[12]．脂肽類化合物主要包括3個家族：表面活性素(Surfactin)、豐原素(Fengycin)和伊枯草菌素(Iturin)，這類化合物具有很強的抗菌活性[13-14]，其主要作用于病原菌細胞膜或細胞壁[15-17]．李生樟等[18]研究報道B.velezensis504菌株基因組含有編碼脂肽類和聚酮糖類抑菌化合物的基因簇，并能夠特異性拮抗黃單胞菌； Jin等[19]報道了B.velezensisS3-1菌株可產生屬于豐原素、伊枯草素和表面活性素家族的13種脂肽類抗生素，且能抑制植物病原菌Botryiscinerea生長。

本研究以植物炭疽病菌Colletotrichumsp.為靶標菌，對一株具有廣譜抑菌活性的拮抗B.velezensisSWUJ1[20]進行全基因組測序，并對其抑菌物質進行分離純化，初步探究其抑菌機理，為該菌進一步開發成生防制劑奠定前期研究基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料與培養基

供試植物炭疽病菌Colletotrichumsp.和拮抗菌株B.velezensisSWUJ1為本實驗室收集保存[20]。

PDA培養基(g/L)：土豆200.0，葡萄糖20.0，瓊脂15.0～20.0； PDB培養基(g/L)：土豆200.0，葡萄糖20.0； LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，瓊脂15.0～20.0； 改良PDB培養基和Landy培養基分別參考文獻[20]和文獻[21]配制。

1.2 菌株活化及抑菌效果檢測

植物炭疽病菌Colletotrichumsp.和拮抗細菌B.velezensisSWUJ1活化的具體方法為：取甘油保種的真菌菌餅和細菌菌液分別接種至新鮮的PDA和LB培養基上進行活化，真菌于25 ℃培養7 d，細菌于28 ℃培養1 d．采用平板對峙法[22]檢測抑菌活性：將B.velezensisSWUJ1新鮮培養物接種于PDB培養基，28 ℃搖床180 r/min振蕩培養24 h，獲得菌懸液； 用直徑為5 mm的打孔器在長滿新鮮植物炭疽病菌Colletotrichumsp.菌絲的PDA平板邊緣取菌餅，接種至新的PDA平板中央，同時在距離病原菌邊緣30 mm的對稱處劃線接種新鮮拮抗細菌，以僅培養病原菌的PDA平板為對照，各設3個重復，25 ℃培養9 d后測量病原菌的菌落直徑，計算抑菌率．用滅菌牙簽挑取培養9 d對照組病原菌正常生長菌絲，以及處理組處于抑菌帶邊緣的病原菌菌絲制片，在光學顯微鏡下觀察病原菌菌絲形態．菌落直徑和抑菌率的計算公式為：

1.3 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1全基因組測序

1.3.1 拮抗菌株基因組DNA的提取

挑取新鮮B.velezensisSWUJ1單菌落接于LB液體培養基，37 ℃搖床培養16 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體，參照Qiagen試劑盒的方法進行基因組DNA的提?。畼悠芳兌?A260/280處于1.8～2.0之間)、質量濃度(>100 ng/μL)檢測合格后，送至武漢未來組生物科技有限公司進行全基因組測序。

1.3.2 基因組DNA測序與組裝

利用Oxford Nanopore Technology測序儀GridION對DNA進行單分子測序，建庫完后將一定濃度和體積的DNA文庫加入到流通池中，并將其轉移到GridION測序儀進行實時單分子測序，獲得原始數據，并對質控后的數據進行基因組組裝、矯正及優化。

1.3.3 基因預測與功能注釋

編碼基因用prodial進行預測，保留完整的編碼序列(CDS)．提取基因組編碼蛋白后，用Interprosca進行注釋，提取GO數據庫的注釋信息； 用blastp比對編碼蛋白到KEGG數據庫，保留比對覆蓋度大于30%的最好結果作為注釋結果； 用rpsblast比對編碼蛋白到COG數據庫進行注釋．采用在線預測軟件antiSMASH 5.0.0(https：//antismash．secondarymetabolites．org/#!/start)對菌株SWUJ1次級代謝產物合成基因簇進行預測分析，尋找潛在的抑菌代謝產物合成基因簇。

1.4 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵濾液熱穩定性檢測

將新鮮B.velezensisSWUJ1菌株接種于LB液體培養基，28 ℃、180 r/min振蕩培養16 h，獲得新鮮種子液．將SWUJ1菌株種子液按1%的接種量接種至改良PDB培養基，于25 ℃及180 r/min條件下培養4 d，將菌懸液在8 000 r/min條件下離心20 min，棄菌體沉淀，取上清過0.22 μm濾膜，得到無菌發酵濾液； 分別用40，60，80，100 ℃金屬浴熱處理發酵濾液30 min，冷卻至室溫，以未做熱處理的發酵濾液為對照，檢測各組濾液的抑菌活性； 采用抑菌圈法[23]檢測發酵液抑菌活性：用直徑為5 mm的打孔器在長滿新鮮植物炭疽病菌Colletotrichumsp.菌絲的PDA平板邊緣處取菌餅，接種至新的PDA平板中央．25 ℃培養2 d后，在試驗平板上距病原菌邊緣15 mm處，用直徑為5 mm的無菌打孔器打孔，往孔中注入80 μL無菌發酵濾液．每個處理設置3個重復，25 ℃培養2 d后，測量抑菌帶大小。

1.5 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵液粗提物的制備

1.5.1 菌株活性發酵上清液的制備

基于拮抗菌株的全基因組分析和發酵濾液的熱穩定性，推測該菌活性產物可能為脂肽類抗生素，故選用芽孢桿菌產脂肽常用的Landy培養基作為發酵培養基，利用發酵罐進行菌株體外擴大培養，具體發酵條件為：50 L發酵罐，裝量31 L，接種量為10%，25 ℃，pH值為7.0，300 r/min攪拌培養3 d后，8 000 r/min離心20 min，取發酵上清液備用。

1.5.2 活性物質的粗提

采用酸沉淀法[24]提取活性發酵液中的抑菌物質，具體方法為：用6 mol/L濃HCl將1.5.1制備的發酵上清液的pH值調至2.0，4 ℃靜置沉淀12 h； 4 ℃，8 000 r/min離心20 min收集沉淀，待沉淀自然干燥后加適量甲醇溶解； 多次抽濾至濾液無活性，合并濾液，旋轉蒸發濃縮粗提物。

1.5.3 抑菌活性的檢測

采用紙片抑菌圈法[23]檢測發酵液粗提物對炭疽病菌的抑菌活性，具體方法為：將新鮮病原菌菌餅接種在PDA平板中央，并在距離菌餅中心20 mm處放置無菌濾紙片，在濾紙片上加入20 μL發酵液粗提物，以滴加等量甲醇為空白對照，22 ℃培養5 d，觀察是否形成抑菌帶，以此判斷發酵液粗提物的抑菌活性。

1.6 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵液脂肽類抑菌物質的分離鑒定

對獲得的發酵液粗提物進行LC-MS分析，具體方法參考文獻[25]：LC-MS分析使用Agilent 1290 Infinity Ultra Performance Liquid Chromatography與Agilent 6545 UHD and Accurate-Mass Q-TOF質譜聯用儀．色譜柱型號為Waters XSelect?HSS T3柱(2.5 μm，100 mm×2.1 mm)； 流動相：A為水溶液(0.1%甲酸)，B為乙腈(0.1%甲酸)； 流速設置為0.35 mL/min，柱溫為40 ℃．進樣量：正離子模式1 μL，負離子模式2 μL．優化的色譜梯度：0～2 min，5% B； 2～10 min，5%～95% B； 10～15 min，95% B．運行時間設為5 min，用于平衡系統．質譜使用正離子模式結合負離子模式，優化的參數如下：毛細管電壓為3.5 kV； 干燥氣流為10 L/min； 氣體溫度為325 ℃； 噴霧器壓強為1 363.9 kPa； 碎裂電壓為120 V； 取樣錐電壓為45 V．質譜的采集范圍50～3 000m/z，數據系統分析使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B. 08.00 software(Agilent Technologies，USA)。

1.7 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵液小分子抑菌物質的分離純化

采用C18反相柱層析對發酵粗提物進行分離，以20%，40%，60%，80%的甲醇進行梯度洗脫，流速為20 mL/min，分別收集各梯度洗脫液，濃縮后用紙片抑菌圈法檢測各分離組分對炭疽病菌的抑菌活性．用直徑為0.22 μm的濾膜對活性較好的組分進行過濾，利用漢邦高效液相色譜儀，以YMC-Pack ODS-A液相色譜柱(C18柱)進一步分離純化抑菌活性組分．以水為流動相A，乙腈為流動相B，按表1方法進行分離純化，濃縮后用紙片抑菌圈法檢測各分離組分對炭疽病菌的抑菌活性．利用Sephadex LH-20凝膠層析對活性較好的組分進行分離，洗脫劑為甲醇，每5 mL收集一個組分，各組分通過薄層色譜(TLC)點板合并，以炭疽病菌為指示菌，采用96孔板法測定各合并組分的抑菌活性，具體方法為：在96孔板的小孔內各自加入100 μL PDB培養基．對照組中加入10 μL甲醇，處理組中加入10 μL分離組分，25 ℃培養3 d，觀察炭疽病菌生長情況。

表1 高效液相色譜設置方法

1.8 活性物質最低抑制質量濃度的測定及其對病原菌菌絲形態的影響

取5 mg分離獲得的單峰物質溶于1 mL的甲醇溶液，配制成5 000 μg/mL的抑菌溶液．在96孔板中分別加入抑菌溶液，待其風干后，加入100 μL PDB培養基，每孔樣品質量濃度依次為500，450，400，350，300，250，200，150，100，50 μg/mL．每孔加入大小均一的Colletotrichumsp.菌塊，以甲醇及PDA塊為對照，25 ℃培養3 d，觀察真菌的生長情況，確定真菌完全被抑制時的最低抑菌濃度(MIC)，實驗平行重復3次，并在光學顯微鏡下觀察活性化合物對病原菌菌絲形態的影響。

2 結果和分析

2.1 B. velezensis SWUJ1菌株的抑菌效果

平板對峙實驗結果顯示，B.velezensisSWUJ1對供試炭疽病菌生長具有較好的抑制作用(圖1a)，其抑菌率可達58.90%，而對照組病原菌菌絲長滿整個平板(圖1b)．對不同組真菌菌絲進行顯微觀察，結果表明B.velezensisSWUJ1處理組的炭疽病菌部分菌絲扭曲、畸形、腫大，且內容物聚集(圖1c)，而對照組真菌菌絲無色透明、細長、光滑勻整(圖1d)，說明B.velezensisSWUJ1菌株對病原菌菌絲有明顯的破壞作用。

圖1 B. velezensis SWUJ1菌株對病原菌的抑制作用(25 ℃下培養9 d)

2.2 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1全基因組分析

2.2.1B.velezensisSWUJ1全基因組組裝

B.velezensisSWUJ1菌株全基因組測序結果表明，該菌染色體全長為3，926，914 bp，基因組GC含量為46.53%，共得到3 732個完整的CDS，占整個基因組序列的88.62%．非編碼RNA中包含27個rRNA和86個tRNA，分別占整個基因組序列的1.05%和0.17%(圖2)，且該菌中未發現質粒．將該菌的基因組測序結果提交GenBank，登錄號為CP077672。

由外到內依次為：圈1為基因組大小，圈2為編碼基因正義鏈，圈3為編碼基因負義鏈，圈4為非編碼RNA，圈5為GC比，圈6為GC-skew，圈7為測序深度．圖2 B. velezensis SWUJ1菌株基因組圈圖

2.2.2 基因預測與功能注釋

對B.velezensisSWUJ1菌株編碼基因在GO數據庫進行功能注釋分析(圖3a)，結果表明在分子功能中參與催化、結合、運輸活性相關的基因占比較大； 生物學過程中參與代謝過程、細胞過程和單組織過程類別的基因較多； 細胞組分中參與細胞、細胞膜、細胞部位、細胞膜部位的基因比例較大，表明B.velezensisSWUJ1的基因多集中在酶催化、代謝以及細胞分化等過程．將CDS與COG數據庫比對分析，結果表明B.velezensisSWUJ1菌株基因組中編碼氨基酸轉運和代謝蛋白、轉錄蛋白和碳水化合物轉運代謝蛋白的比例較大(圖3b)．對B.velezensisSWUJ1的基因組編碼蛋白進行KEGG功能分類統計，結果表明該菌參與代謝功能的基因占比最多，其中編碼碳水化合物轉運與代謝基因的數目占比達22.86%(圖3c)。

圖3 B. velezensis SWUJ1菌株基因組編碼蛋白的功能分類

基因功能注釋結果顯示，B.velezensisSWUJ1基因組中含有屬于NRPS途徑的表面活性素、豐原素、溶桿菌素和嗜鐵素4類抑菌物質合成相關基因，以及由PKS-NRPS途徑催化的伊枯草菌素(Iturin)和聚酮類化合物Bacillaene合成相關基因(表2)．其中comA可激活由srfAA，srfAB，srfAC構成的操縱子，從而調控表面活性素的合成[26]；fenC，fenD，fenE，fenA和fenB為編碼豐原素合成酶的基因[27]；bacA，bacG，bacF的編碼蛋白是成熟溶桿菌素形成的關鍵酶[28]； 編碼雙模塊非核糖體肽合成酶的基因dhbF參與嗜鐵素的合成[29]．與表面活性素、豐原素不同，伊枯草菌素由PKS-NRPS雜化復合物合成，ituA，ituB和ituC是其操縱子的3個開放閱讀框[30]； 聚酮類化合物Bacillaene也是雜化PKS-NRPS的自然產物，pksJ，pksL和pksM等參與了Bacillaene的生物合成[31]。

表2 B. velezensis SWUJ1菌株抑菌相關基因統計

2.2.3 次級代謝基因簇分析

通過antiSMASH 5.0.0軟件在線預測B.velezensisSWUJ1菌株的次級代謝產物，結果顯示該菌基因組中存在13個次級代謝產物合成基因簇．其中，除萜烯(Terpene)、第3類聚酮類化合物(T3PKS)、細菌素(Bacteriocin)和Cluster 11代謝物類型未知外，其余8個基因簇均可以合成芽孢桿菌中常見且具抑菌活性的次級代謝產物：Cluster 1，表面活性素合成基因簇； Cluster 2，丁酰苷菌素合成基因簇； Cluster 4，大環內酯合成基因簇； Cluster 5，Bacillaene合成基因簇； Cluster 6，豐原素合成基因簇； Cluster 10，Difficidin合成基因簇； Cluster 12，鐵載體合成基因簇； Cluster 13，溶桿菌素合成基因簇．Cluster 1，Cluster 6，Cluster 11和Cluster 12基因簇均通過非核糖體途徑合成相應的次級代謝產物(表3)。

表3 B. velezensis SWUJ1菌株次級代謝產物的預測

2.3 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵濾液熱穩定性

B.velezensisSWUJ1菌株發酵濾液經不同溫度熱處理后，對病原菌的抑菌活性與未經熱處理的對照相比差異無統計學意義，其中40 ℃熱處理30 min后抑菌能力無明顯變化，60，80，100 ℃熱處理30 min后抑菌能力略有下降(圖4)(p>0.05)，表明發酵上清液中的活性物質具有較好的熱穩定性，有利于后續B.velezensisSWUJ1菌株生防制劑的制備和應用．綜合B.velezensisSWUJ1菌株全基因組分析及活性發酵液的熱穩定性結果，初步判斷抑菌物質可能為脂肽類物質或小分子活性物質，有利于后續活性物質分離純化的研究。

圖4 溫度對B. velezensis SWUJ1菌株發酵濾液抑菌活性物質的影響

2.4 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵液脂肽類抑菌物質的分離鑒定結果

對B.velezensisSWUJ1菌株發酵液粗提物進行LC-MS分析，結果顯示該菌株抑菌活性物的粗提物在m/z值為1 008.68和1 022.70處有離子峰(簇)出現，這2個離子峰的相對分子質量依次相差14(脂肪酸鏈結構“—CH2—”)，分別對應于表面活性素(C12—C15)的相對分子質量(圖5a)； 在m/z值為1 447.77，1 461.78，1 475.80和1 489.81處有4離子峰(簇)出現，分別對應豐原素(C14—C18)的相對分子質量(圖5b)； 在m/z值為1 006.64，1 020.65，1 034.67和1 048.69處有4離子峰(簇)出現，分別對應伊枯草菌素(C12—C17)的相對分子質量(圖5c)．通過比較離子響應強度發現，抑菌活性物中的豐原素含量較少，表面活性素和伊枯草菌素相對較多．以上結果表明，菌株B.velezensisSWUJ1可能通過產生脂肽類化合物表面活性素、豐原素和伊枯草菌素抑制病原菌生長。

圖5 B. velezensis SWUJ1菌株活性發酵液粗提物的LC-MS分析

2.5 拮抗菌株B. velezensis SWUJ1發酵液小分子抑菌物質的分離純化結果

通過紙片抑菌圈法檢測菌株發酵液粗提物的抑菌活性，結果表明菌株發酵液粗提物具有較好的抑菌活性(圖6a)．對發酵粗提物進行中壓反相柱層析，其中20%甲醇洗脫組分具有良好抑菌活性，進而利用HPLC對該組分進行分離純化，共收集獲得8個組分(Ⅰ-Ⅷ)，其中4個組分有抑菌活性(Ⅱ-Ⅴ)．利用Sephadex LH-20凝膠層析對活性最強的Ⅴ組分(保留時間為20.5 min)進一步分離純化，獲得Ⅴ1-Ⅴ4等4個組分．利用96孔板對各組分的抑菌活性進行檢測，結果表明Ⅴ2組分有明顯抑菌效果(圖6b)。

圖6 B. velezensis SWUJ1菌株發酵液粗提物及凝膠層析各組分抑菌活性檢測

利用HPLC對Ⅴ2組分進一步制純，得到單峰物質，命名為Ⅴ21(圖7a)．干燥后為黃色粉末，將其配置成初始質量濃度為5 000 μg/mL的溶液，梯度稀釋后檢測其對病原菌的抑制作用，結果表明Ⅴ21組分有明顯的抑菌作用(圖7b)，且其最低抑菌質量濃度(MIC)為200 μg/mL； 鏡檢結果表明，與未加Ⅴ21的病原菌絲相比，質量濃度為150 μg/mL的Ⅴ21組分可使病原菌的部分菌絲扭曲、畸化和膨大(圖7c)。

3 小結與討論

分離自土壤環境中的B.velezensisSWUJ1菌株對香樟炭疽病菌具有較好的抑制作用，且通過對培養基成分和發酵條件進行優化，顯著提升了B.velezensisSWUJ1的抑菌活性[20]，但有關該菌株的抑菌活性物質及抑菌機制尚不清楚．本研究對B.velezensisSWUJ1菌株進行了全基因組測序，并對抑菌活性物質進行分離純化，以期初步探究該菌的抑菌機制．結果表明B.velezensisSWUJ1菌株具有合成表面活性素、豐原素、Bacillaene和Bacilysin等抗菌物質的相關基因簇，通過LC-MS分析進一步發現該菌發酵液中存在表面活性素、豐原素和伊枯草菌素3種脂肽類抑菌物質，并獲得了一個具有較好抑菌活性的Ⅴ21組分，其最小抑菌濃度為200 μg/mL．徐楊等[32]從海洋枯草芽孢桿菌3512A獲得的脂肽類抗菌化合物在氘代試劑中溶解性差，未能獲得理想的二維核磁共振數據，利用電噴霧飛行時間質譜解析也未能獲得氨基酸裂解順序，表明獲得的抗菌化合物可能是新型脂肽類成分．本研究獲得的Ⅴ21組分在氘代試劑中溶解性亦不佳，僅由一維核磁共振氫譜、碳譜圖譜分析尚不能得到其確切結構，經微譜數據比對，可能是Bacillopeptins或Bacillomycin D等脂肽類物質，其結構需進一步確定．黃承敏等[33]研究表明芽孢桿菌HN-7菌株發酵上清液經121 ℃處理20 min后仍具有很強的抑菌活性．本研究中B.velezensisSWUJ1菌株的抑菌活性發酵濾液亦具有較好的熱穩定性，其在100 ℃處理后抑菌活性無顯著變化，說明B.velezensis的活性濾液具有較高的熱穩定性，這將有利于其在田間施用。

B.velezensis是一種十分具有生物防治潛力的優勢菌種．劉雪嬌等[34]在B.velezensis3A3-15脂肽類抗生素的粗提物中發現了表面活性素(C14—C15)，該菌產生的抑菌物質可使尖孢鐮刀菌菌絲發生膨大、彎曲、纏繞等畸化現象．遲惠榮等[35]利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在B.velezensisV4中檢測到了表面活性素和伊枯草菌素等抑菌物質．Li等[36]發現B.velezensis1B-23不僅可以產生表面活性素、伊枯草菌素，也可產生大環內酯、環二肽等抑菌物質抑制多種病原菌．后續研究將在本文研究基礎上，進一步挖掘其生防相關基因，展開關鍵遺傳調控元件及表達系統的研究，深入探究該菌拮抗病原真菌的抑制機理。