Trolox對豬肌肉干細胞增殖及分化的影響

胡榮蓉，丁世杰，郭赟，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，唐長波，周光宏

Trolox對豬肌肉干細胞增殖及分化的影響

胡榮蓉，丁世杰，郭赟，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，唐長波，周光宏

南京農業大學食品科技學院/國家肉品質量安全控制工程技術研究中心/教育部肉品加工與質量控制重點實驗室；南京 210095

【目的】探究抗氧化劑-水溶性維生素E的類似物（Trolox）通過調控活性氧對豬肌肉干細胞增殖及分化過程產生的影響，為進一步優化培養肉種子細胞在體外增殖及分化過程提供研究基礎?！痉椒ā渴紫仍谪i肌肉干細胞增殖過程中，添加不同濃度（0、50、100和200 μmol?L-1）的Trolox培養3 d，利用血細胞計數板進行細胞計數，統計細胞增殖倍數，同時利用CCK8技術檢測不同濃度的Trolox對細胞增殖的影響；利用RT-qPCR技術檢測不同濃度Trolox處理后表征干性的表達水平，Western Blotting技術檢測PAX7蛋白的表達水平；通過CellROX熒光染料對細胞內活性氧進行染色并通過高通量高內涵活細胞共聚焦成像系統檢測Trolox對活性氧的調控作用；進一步在豬肌肉干細胞體外成肌分化進程中添加Trolox處理，利用RT-qPCR技術檢測分化早期標志基因、及終末分化標志基因肌球蛋白重鏈（）的表達水平，并利用Western Blotting技術檢測MyHC蛋白的表達，利用免疫熒光技術對MyHC進行染色并統計陽性細胞比例。【結果】細胞增殖倍數統計顯示，50和100 μmol?L-1的Trolox處理組豬肌肉干細胞增殖倍數顯著高于對照組（<0.05）；CCK8測得50和100 μmol?L-1Trolox處理組第3天的吸光值顯著高于對照組（<0.05）；100和200 μmol?L-1的Trolox顯著上調了的表達（<0.05），對PAX7蛋白的表達有上調趨勢，但無顯著差異（>0.05）；添加Trolox后，細胞內活性氧水平被極顯著降低（<0.001）；在分化進程中添加Trolox后，預分化階段的和及終末分化階段的均顯著上調（<0.05），而Western blotting結果顯示MyHC蛋白的表達無顯著變化（>0.05）；免疫熒光結果顯示陽性細胞比例有增多的趨勢，但無顯著差異（>0.05）?！窘Y論】Trolox通過降低細胞內的活性氧，促進豬肌肉干細胞的增殖以及分化進程。

Trolox；豬肌肉干細胞；活性氧；增殖；分化

0 引言

【研究意義】細胞培養肉技術作為一項高效、環保、可持續的新型肉類生產方式，近年來逐漸成為研究熱點[1-3]。目前，肌肉干細胞是培養肉生產中最具有潛力的種子細胞。通過體外分離與培養，肌肉干細胞定向分化形成多核肌細胞，并表達肌肉特有的肌球蛋白重鏈，形成肌肉纖維組織[4-5]。然而隨著培養時間的增加，肌肉干細胞的增殖及分化能力出現明顯下降[6-8]，從而影響培養肉的生產效率。【前人研究進展】研究表明，干細胞增殖與分化的過程受信號轉導、氧化還原狀態及培養環境等因素的影響[9-13]，其中氧化還原狀態對干細胞增殖及分化的影響尤為重要[14-15]。細胞內氧化還原狀態主要由活性氧的產生及抗氧化系統對其的清除來調控，因此，活性氧水平在一定程度上可以表示細胞內氧化還原狀態[16-17]。干細胞退出靜息狀態進入增殖、分化的進程，主要的代謝方式會發生從糖酵解到氧化磷酸化的轉換，同時伴隨著活性氧產生的增加[18-19]。然而，過量的活性氧會造成干細胞功能受損，Gu等[20]發現間充質干細胞體外培養積累過量的活性氧導致細胞增殖及分化能力衰退；而L'HONORE等[21]也發現在小鼠的肌肉干細胞體外培養過程中，持續升高的活性氧抑制了細胞增殖，并作為信號分子誘導肌肉干細胞的分化；MALINSKA等[22]在C2C12小鼠肌肉細胞系中也發現活性氧的升高誘導細胞從增殖進入分化進程。Trolox是水溶性維生素E的類似物，其作為一種標準的抗氧化劑，能夠減少細胞的氧化損傷，如HORN等[23]研究發現Trolox能夠抑制間充質干細胞在氧化應激條件下的凋亡及炎癥發生；此外，多數研究表明，Trolox可直接通過調控細胞內的活性氧從而影響細胞的生理功能；例如FROTA JUNIOR等[24]發現Trolox通過降低活性氧提高神經細胞在體外的細胞活力并促進神經突生成?！颈狙芯壳腥朦c】前期研究提示活性氧對干細胞增殖及分化的影響因劑量水平及細胞類型等的不同而存在差異[25]；目前活性氧對肌肉干細胞增殖及分化影響的研究主要集中在小鼠肌肉干細胞上，關于豬等畜禽類動物領域的研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過抗氧化劑—Trolox對豬肌肉干細胞內的活性氧進行調控，研究Trolox對豬肌肉干細胞體外增殖及分化過程的影響，進一步探討活性氧對豬肌肉干細胞增殖及分化的調控作用，從而為培養肉的規模化生產提供研究基礎。

1 材料與方法

試驗于2020年在南京農業大學國家肉品質量安全控制工程技術研究中心進行。

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 七日齡幼豬，由蘇食集團生豬養殖基地提供。

1.1.2 主要試劑 澳洲胎牛血清、Ham’s F-10營養培養基、bFGF、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），購于美國GIBCO公司；100×青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰酶，購于上海貝博生物公司；CellROX? Deep Red試劑，購于英濰捷基（上海）貿易有限公司；Trolox，購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；RIPA裂解液（強），購于上海碧云天生物技術有限公司；培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒，購于天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒，購于美國Thermo公司；Trizol總RNA提取試劑，購于英濰捷基（上海）貿易有限公司；TB Green? Premix Ex Taq? II、PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time，均購于日本Takara公司；Tris-MOPS-SDS電泳緩沖液、免疫印跡PVDF膜，購于南京金斯瑞生物科技有限公司；PAX7一抗（貨號：PAX7），購于DSHB公司；MyHC一抗（貨號：ab37484），購于Abcam公司；GAPDH一抗（貨號：MAB374），購于Millipore公司；鼠二抗（貨號：CW2333S），購于Cwbiotech公司；CCK-8 Kit，購于南京木林森生物科技有限公司；免疫熒光鼠二抗（貨號：A11005），購于美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬肌肉干細胞體外短期培養 以七日齡幼豬P5代的肌肉干細胞為研究對象，按照1.5×105個細胞的密度將細胞接種到直徑為10 cm且底部鋪有膠原的培養皿中，首先在基礎培養基中添加重組人成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），生長因子與培養基的添加比例為1﹕2 000；再添加提前通過DMSO配制好的0、50、100和200 mmol?L-1的Trolox，Trolox與培養基的添加比例為1﹕1 000（Trolox終濃度為0、50、100和200 μmol?L-1），2 d換一次液。培養3 d后去除原培養基，用4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去殘留的原培養基，然后通過0.25%的胰酶將細胞從培養皿上消化下來，收集細胞后使用血細胞計數板進行細胞計數，并統計細胞增殖倍數。

1.2.2 CCK8檢測豬肌肉干細胞增殖情況 將P5代豬肌肉干細胞以1×104/mL接到96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，試驗組培養基含有50、100和200 μmol?L-1的Trolox，對照組不含Trolox，在37℃、5% CO2的培養箱中分別培養1、2和3 d，每隔24 h，加入10 μL的CCK8試劑，在培養箱中孵育1 h，通過酶標儀測定450 nm處的吸光值。

1.2.3 豬肌肉干細胞內活性氧水平的測定 參照L'honore等[21]的方法，將細胞以1×104/mL接到96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，分別培養1、2、3和4 d，試驗組培養基含有100 μmol?L-1的Trolox，對照組不含Trolox；然后進行CellROX染色；CellROX染色具體操作步驟為：吸去細胞原培養基，更換添加含有CellROX Deep Red試劑的新鮮培養基，CellROX Deep Red試劑與培養基的配制比為1﹕500；將細胞放置在37℃的二氧化碳培養箱孵育30 min；吸去培養基，PBS清洗3次，更換添加含有Hoechst試劑的新鮮培養基，Hoechst與培養基的配制比為1﹕1 000；將細胞置于37℃的二氧化碳培養箱孵育5 min；吸去培養基，PBS清洗3次；添加100 μL新鮮培養基覆蓋細胞，在活細胞狀態下進行高通量高內涵活細胞共聚焦成像系統檢測。

1.2.4 RT-qPCR檢測相關基因的表達量 收集狀態良好的細胞，加入Trizol試劑裂解細胞，抽提細胞總RNA；按照天根RNA試劑盒的操作技術說明書提取RNA，超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度；通過TAKARA的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒進行PCR反應測定，按照操作技術說明書展開操作，RT-qPCR標準程序為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，循環40次，然后繪制曲線。使用2-△△CT的方法計算目的基因在不同cDNA模板中的相對表達量。

1.2.5 Western blotting檢測相關蛋白的表達 使用RIPA裂解細胞并提取總蛋白，通過BCA法測定總蛋白的濃度；加入Loading Buffer在95℃下進行蛋白變性；取適量的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），電泳結束后進行轉印，轉印結束后蛋白轉移至PVDF膜，封閉1.5 h；4℃下孵育一抗14—16 h（PAX7終濃度為0.5 μg?mL-1，MyHC的稀釋比例為1﹕1 000）、二抗孵育2 h（稀釋比例為1﹕2 000）；顯影拍照；使用Quantity one軟件進行蛋白條帶的灰度值分析。

1.2.6 免疫熒光鑒定肌管的形成 細胞分化結束后吸去分化培養基，PBS清洗1遍，用4%多聚甲醛（PFA）固定，并在4℃下過夜；然后用0.5% Triton X-100通透30 min，PBS清洗3遍；加入一抗（MyHC的稀釋比為1﹕800）在4℃下孵育過夜，PBS清洗3遍；然后加入二抗（稀釋比例為1﹕500）在室溫下孵育1 h，PBS清洗3遍；滴加含DAPI的防熒光猝滅劑，蓋上合適的蓋玻片，在玻片周圍滴加指甲油封片，在共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3 統計分析

應用GraphPAD Prism 8.0軟件進行數據統計分析，采用One-way ANOVA、檢驗方法對數據進行顯著性差異分析。每組試驗均設置3個生物學重復，所有數據均以“平均數±標準差”表示；每個生物學重復至少采集3個技術重復或視野。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結果

2.1 豬肌肉干細胞體外短期培養的形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察短期培養1、2和3 d的豬肌肉干細胞，培養1 d的細胞主要發生貼壁過程，細胞數量少、體積小，細胞形態呈球形或偏梭形；隨著培養天數的增加，細胞數量增多，細胞體積開始變大且形態趨于穩定，主要呈長梭形或者紡錘形，呈典型肌肉干細胞形態（圖1）。

2.2 Trolox對豬肌肉干細胞體外增殖的影響

從倒置顯微鏡觀察，Trolox處理組的細胞數目較對照組更多，細胞體積略?。▓D2-A—D）。細胞增殖倍數統計顯示（圖2-E），較對照組，50、100和200 μmol?L-1的Trolox處理組分別增殖了1.26倍、1.22倍、1.07倍，其中50和100 μmol?L-1的Trolox處理組細胞增殖倍數顯著高于對照組（<0.05）。進一步通過CCK8法檢測Trolox對細胞增殖的影響，結果顯示（圖2-F），50和100 μmol?L-1的Trolox處理組3 d的吸光值顯著高于對照組（<0.05）。綜上，Trolox對豬肌肉干細胞的增殖具有促進作用，且適宜的促增殖濃度為50和100 μmol?L-1。

A—C：培養1、2、3 d的豬肌肉干細胞（50×）；D—F：培養1、2、3 d的豬肌肉干細胞（200×）

A—D：分別為0、50、100和200 μmol?L-1的Trolox培養3 d后的豬肌肉干細胞（50×）；E：不同濃度的Trolox培養3 d后豬肌肉干細胞的增殖倍數；F：CCK8法檢測不同濃度的Trolox培養1、2和3 d豬肌肉干細胞的增殖情況

2.3 Trolox對豬肌肉干細胞內活性氧的調控

檢測Trolox對細胞內活性氧的影響，探究Trolox是否通過發揮其抗氧化特性—降低活性氧[26-27]，從而促進豬肌肉干細胞的增殖。通過CellROX熒光染料對細胞內活性氧染色以及高通量高內涵活細胞共聚焦成像系統的檢測結果顯示，在豬肌肉干細胞短期培養過程中（1—3 d為正常短期增殖時期，第4天為細胞增殖至長滿培養皿，即預備分化的階段），Trolox處理組單個細胞CellROX染色的單位面積平均熒光強度（圖3-C）、熒光染色面積（圖3-D）顯著低于對照組（<0.05），最后通過計算每個細胞CellROX染色的總熒光強度，顯示Trolox處理組每個細胞CellROX染色的總熒光強度被極顯著降低（圖3-E）（<0.001），表明Trolox處理后，細胞內的活性氧被顯著降低。以上結果進一步表明降低體外培養過程中豬肌肉干細胞內的活性氧能夠促進其增殖，說明活性氧對豬肌肉干細胞的增殖具有一定的抑制作用。

2.4 Trolox對豬肌肉干細胞干性基因PAX7的影響

培養肉的生產需要在體外獲得大量的肌肉干細胞，同時要求其具有較高的分化潛能，肌肉干細胞的增殖能力以及分化潛能表征著其“干性”，PAX7是衡量肌肉干細胞體外培養干性水平的重要指標[28-29]。RT-qPCR以及蛋白免疫印跡技術對PAX7的檢測結果顯示，在轉錄水平（圖4-A），Trolox處理組的表達量隨Trolox濃度升高而升高，其中100和200 μmol?L-1的Trolox處理組的表達量分別顯著上調了65%（<0.05）和111.6%（<0.01）；而100和200 μmol?L-1的Trolox處理組PAX7蛋白的表達量較對照組有上調的趨勢，但無顯著差異（圖4-B）。結果表明Trolox在一定程度上能夠維持豬肌肉干細胞體外培養的干性。

圖4 不同濃度的Trolox對PAX7的影響

2.5 Trolox對豬肌肉干細胞分化的影響

體外培養豬肌肉干細胞（圖5-A），使其增殖4 d至細胞長滿培養皿、細胞匯合度達到90%時為肌肉干細胞的預分化階段（圖5-B），隨即更換分化培養基，誘導細胞分化5 d，至70%的細胞融合形成多核肌管，即終末分化結束（圖5-C）。

選用對豬肌肉干細胞促增殖作用及對干性基因上調作用較明顯的100 μmol?L-1Trolox進行分化進程試驗。是早期標志生肌分化調控因子，能夠推進肌肉干細胞肌源性分化進程并啟動肌源性祖細胞的終末分化[30]；是標志肌細胞融合的基因，其表達量隨著肌細胞融合數量的增加而增加[31]。通過RT-qPCR技術對預分化階段和表達的檢測結果顯示（圖5-D—E），Trolox處理組、的表達顯著上調，較對照組分別顯著上調145.7%、87.4%（<0.05）。

肌球蛋白重鏈標志著肌肉干細胞終末分化階段多核肌管的形成，通過RT-qPCR以及蛋白免疫印跡技術對的檢測結果顯示，在轉錄水平（圖5-F），無論是在增殖時期還是進入分化的過程添加Trolox，對的表達都有顯著上調作用，其中在增殖及分化兩個過程都添加Trolox的處理組上調最顯著，較對照組顯著上調了81.5%（=0.0003），而只在增殖階段以及只在分化階段添加Trolox的處理組分別顯著上調33.1%（<0.01）、31.0%（<0.05）；然而在翻譯水平（圖5-G），與對照組相比，Trolox對MyHC蛋白的表達無顯著影響；通過免疫熒光技術對肌管進行染色（圖5-H—K），統計肌管中的細胞核占樣品中總細胞核的比例，其可以表征肌細胞融合指數[6]，統計結果顯示（圖5-L），Trolox處理后，MyHC陽性細胞比例有增多的趨勢，但無顯著差異。以上結果表明，Trolox能夠促進豬肌肉干細胞的分化進程。

3 討論

迄今為止，肌肉干細胞對肌肉再生及肥大的貢獻已被大量研究證實，肌肉干細胞從靜息狀態被激活，在體外進行增殖、分化的過程很好地模擬了肌肉纖維組織的發育途徑，因此，近年來，肌肉干細胞又被作為最具有潛力的種子細胞用于培養肉技術的研究?；钚匝跏钦{節細胞內氧化還原狀態的主要氧化活性物質，參與調控干細胞的增殖及分化過程。研究表明，降低體外培養的干細胞活性氧水平，有助于干細胞的體外擴增；例如BAI等[32]通過使用可降解的兩性離子水凝膠構建體外3D培養環境幫助造血干細胞維持細胞內較低的活性氧水平，從而顯著提高了細胞的擴增能力；此外，還可以通過添加抗氧化物質來調控細胞內的活性氧。唐朝春[33]通過使用多酚類抗氧化物質—白藜蘆醇促進了造血干細胞的體外增殖；在肌肉干細胞的研究中，L'HONORE等[21]通過抗氧化劑—N-乙酰半胱氨酸（NAC）或Trolox處理降低小鼠肌肉干細胞內的活性氧來改善細胞增殖能力的衰退；GARCíA- PRAT等[26]同樣通過使用Trolox抑制細胞內過高的活性氧從而恢復老年小鼠肌肉干細胞的功能特性并增強其用于肌肉組織的修復能力。本研究結果表明Trolox降低增殖過程中細胞內的活性氧水平，促進了豬肌肉干細胞增殖，與L'HONORE等[21]和GARCíA-PRAT等[26]的研究結果相似。本研究結果進一步表明，豬肌肉干細胞在體外培養過程中，細胞內的活性氧對其增殖具有一定的抑制作用?；钚匝鯇Ω杉毎鲋车囊种谱饔每赡苁峭ㄟ^對細胞內功能性的生物大分子如DNA、RNA、蛋白質等進行了氧化修飾?；钚匝跻鸬难趸揎椏梢苑譃閮煞矫?，一方面通過氧化修飾直接或間接地激活某些信號通路從而改變細胞命運，例如在小鼠肌肉干細胞中，活性氧通過氧化磷酸化激活P38 MAPK信號通路，促使其退出細胞周期，提前進入分化進程[21]；另一方面是造成細胞損傷，例如DNA或RNA鏈的斷裂，以及蛋白質氧化造成蛋白質結構發生變化甚至使其失去活性，從而導致細胞功能受損、衰退，如氧化后的肌肉干細胞會發生DNA損傷以及不可逆性衰老[26]，在間充質干細胞長期培養過程中也發現由于活性氧的累積造成細胞周期停滯并且促使細胞衰老、凋亡[20]。關于豬肌肉干細胞體外短期培養過程中，活性氧對其增殖的具體調控機制有待進一步研究。

肌肉干細胞的干性主要表現為其增殖能力及分化潛能，PAX7是肌肉干細胞的特異性核轉錄因子，也是目前公認的衡量肌肉干細胞干性的標志物。有研究表明，PAX7通過抑制初級分化基因的表達以及誘導有絲分裂的一部分肌肉干細胞回到靜息狀態來維持干性；抑制PAX7的表達，肌肉干細胞則無法維持干細胞池且只能走向分化[34]。在體外培養過程中，高表達7的肌肉干細胞被賦予高水平的干性，它們在體外可持續增殖并具備分化成多核肌管的潛能。本研究中，Trolox能夠顯著上調的表達，且在翻譯水平對PAX7蛋白的表達也有上調趨勢，表明Trolox在一定程度上能夠維持豬肌肉干細胞體外培養的干性，與L'HONORE等[21]在小鼠肌肉干細胞中的研究結果類似，這可能與活性氧參與調控肌肉干細胞干性相關的信號通路有關。例如有研究表明，達到一定水平的活性氧可以激活P38 MAPK通路，而P38α信號通路在肌肉干細胞從增殖到分化的進程中起非常重要的作用[35-36]，激活的p38α信號通路可以通過上調JNK磷酸酶MKT-1關閉JNK促增殖通路導致細胞周期蛋白Cyclin D1的下調，從而誘導細胞退出細胞周期[37]；此外，p38α信號通路還可以通過磷酸化Ezh2促進YY1和PRC2之間的相互作用，在PAX7啟動子上形成抑制性染色質，從而下調肌肉干細胞中的表達[38-39]；因此，推測抗氧化劑Trolox可能是通過降低活性氧，抑制了P38 α等信號通路的活化，從而維持肌肉干細胞的干性。

MALINSKA等[22]發現小鼠C2C12肌肉細胞系在分化開始前活性氧劇烈升高；L'HONORE等[21]通過抗氧化劑抑制小鼠肌肉干細胞預分化時期的活性氧，阻止了細胞進入分化進程。這些研究表明，達到一定水平的活性氧是誘導肌肉干細胞分化的信號分子。本研究發現，在豬肌肉干細胞體外短期培養過程中，活性氧水平隨培養時間的增加逐漸下降，且在預分化階段活性氧水平未出現升高的現象；同時，通過在豬肌肉干細胞分化進程中添加抗氧化劑Trolox處理后發現，分化早期標志基因和、終末分化的標志基因都顯著上調，并且免疫熒光結果顯示陽性細胞比例增大，表明抗氧化劑Trolox能夠促進豬肌肉干細胞的分化進程；這與MALINSKA等[22]和L'HONORE等[21]在小鼠肌肉干細胞中的研究結果相反，可能是因為來源于不同類型的動物肌肉干細胞在體外培養過程存在生物學差異。此外，本研究中Trolox顯著上調的表達，而對MyHC蛋白的表達沒有顯著影響，并且同樣的現象也出現在對的檢測結果中，推測可能與mRNA在合成蛋白前后受到轉錄及翻譯后調控的過程有關，mRNA在翻譯成蛋白之前需要經歷一系列轉錄后修飾和加工等過程，且真核生物的轉錄以及翻譯過程存在時間和空間上的有序性[40]，可能會導致蛋白的合成滯后；另外，蛋白合成之后同樣受到翻譯后調控的過程，當蛋白穩定性不好時，在細胞內的更新速度加快，多合成出來的蛋白很快會被降解[41]，因此也可能導致蛋白的變化未能被檢測出來。根據本研究結果，推測豬肌肉干細胞在體外培養過程中細胞內的活性氧對其成肌分化的過程可能存在負調控作用?；钚匝鯇∪飧杉毎杉》只呢撜{控作用可以通過激活某些信號通路從而導致肌源性分化的轉錄因子下調，例如目前研究較多的NF-κB信號通路被認為與骨骼肌分化的負調控直接相關；ARDITE等[42]和GUTTRIDGE等[43]通過外源性氧化應激導致小鼠肌肉干細胞內活性氧升高，升高的活性氧激活NF-κB信號通路，從而直接下調肌源性生肌分化因子的表達，的下調進一步會抑制成肌調節因子和的表達，最終造成成肌分化受損。另有研究表明NF-κB信號通路還可以通過激活細胞周期蛋白cyclin D1促進有絲分裂阻止肌肉干細胞進入分化進程[44]。此外，當活性氧處于異常高水平時，對細胞造成的氧化損傷也會導致肌肉干細胞分化能力的降低，例如在體外突變胚胎肌細胞中氧化還原控制的核心調節因子Pitx2/3，造成調節線粒體功能的核呼吸因子下調，從而引起產生的活性氧劇烈升高，過量的活性氧導致成肌細胞DNA氧化損傷的積累以及成肌分化細胞的凋亡[45]。以上所述研究均是在細胞受到氧化應激的情況下進行的，而本研究中豬肌肉干細胞處于正常生理狀態，未來可以通過建立豬肌肉干細胞的氧化模型來探究活性氧對細胞分化的具體調控機制。

4 結論

抗氧化劑Trolox可通過降低細胞內的活性氧水平促進豬肌肉干細胞的增殖以及成肌分化進程，且能夠維持細胞的干性；研究結果為未來通過調控活性氧優化培養肉種子細胞在體外增殖及分化的過程提供一定的理論基礎。

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Effects of Trolox on Proliferation and Differentiation of Pig Muscle Stem Cells

Hu RongRong, Ding ShiJie, Guo Yun, ZHU HaoZhe, CHEN YiChun, LIU Zheng, DING Xi, TANG ChangBo, ZHOU GuangHong

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University/National Meat Quality and Safety Control Engineering Technology Research Center/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing 210095

【Objective】The objective of this study was to investigate the regulatory effects of Trolox, an antioxidant water-soluble vitamin E analogue, on the proliferation and differentiation of pig muscle stem cells, which possibly was affected by reactive oxygen species. The study could provide a theoretical fundament for further optimizing the proliferation and differentiation process of cultured meat seed cells.【Method】Initially, 0, 50, 100 and 200 μmol·L-1of Trolox was added to pig muscle stem cells during their proliferation culture for 3 d, respectively. The blood cell counter and CCK8 technology were both used to detect the influence of Trolox on the cell proliferation. RT-qPCR was employed to measure the expression level of PAX7 gene for the further characterizing cellular stemness induced by Trolox. Meanwhile, Western Blotting was also used to testify the expression level of PAX7 protein. The intracellular reactive oxygen species was stained by CellROX fluorescent dye, and the High-throughput High-content Live Cell Confocal Imaging System was adopted to evidence the regulatory effect of Trolox on reactive oxygen species. Trolox was additionally used to themyogenic differentiation of pig muscle stem cells. RT-qPCR was used to detect the expression levels of early differentiation marker genes,and terminal differentiation marker gene myosin heavy chain (). Western Blotting was applied to detect the expression of MyHC protein, whereas Immunofluorescence technique stained MyHC and counted the proportion of MyHC positive cells.【Result】The cell proliferation fold statistics indicated that the proliferation fold of pig muscle stem cells in 50 or 100 μmol·L-1Trolox treatment groups was significantly higher than that under the control group (<0.05); CCK8 test showed that the absorbance value under 50 or 100 μmol·L-1Trolox treatment groups on the 3rd day was significantly higher than that under the controls (<0.05); Trolox concentrations at 100 or 200 μmol·L-1significantly up-regulated the expression of PAX7 gene (<0.05), but had no dominant effect for the improvement of PAX7 proteins with no statistical difference (>0.05). The level of reactive oxygen species in the cells was significantly reduced (<0.001) when Trolox applied. Moreover, after the addition of Trolox to the cells in their differentiation process, MYOG and CAV-3 in the predifferentiation stage as well as MyHC genes in the terminal differentiation stage were dramatically up-regulated (<0.05). However, Western Blotting results exhibited that the expression of MyHC protein had no a huge change (>0.05), while the immunofluorescence results displayed that the proportion of MyHC positive cells had an increasing trend but there was no statistical difference (>0.05).【Conclusion】Trolox promoted the proliferation and differentiation of pig muscle stem cells via reducing reactive oxygen species in the cells.

Trolox; pig muscle stem cells; reactive oxygen species; proliferation; differentiation

2021-05-20；

2021-07-31

國家自然科學基金青年項目（31501509）、國家重點研發計劃政府間國際科技創新合作項目（2019YFE0103800）、江蘇省優勢學科建設項目青年創新基金（80900604）

胡榮蓉，E-mail：1119776527@qq.com。丁世杰，E-mail：shijieding@njau.edu.cn。胡榮蓉與丁世杰為同等貢獻作者。通信作者唐長波，E-mail：changbotang@hotmail.com。通信作者周光宏，E-mail：guanghong.zhou@hotmail.com

（責任編輯 趙伶俐）