4種常用消毒劑對布魯氏菌消毒效果的比較

龐滋東,羅麗君,胡 燕,范司平,劉海峰,周紫峣, 彭廣能,沈留紅,馬曉平,馬雪平,鐘志軍

(1. 四川農業大學動物醫學院,四川 成都 611130 ； 2. 解放軍總醫院第三醫學中心檢驗科,北京 海淀 100039)

布魯氏菌(Brucella)是革蘭陰性、需氧、兼性胞內菌，可導致人和動物感染布魯氏菌病(簡稱“布病”，Brucellosis)[1-2]。該病不僅阻礙我國畜牧業健康持續發展，還對公共衛生安全造成巨大威脅，已成為世界上最重要的人獸共患傳染病之一[3-6]。布魯氏菌可經乳汁、糞尿和流產分泌物等排至環境中[7]，并可在土壤、水、肉類食品、糞尿和動物皮毛上存活數天至數月不等[8]。因此，針對布魯氏菌病的防控，消毒是現代養殖中貫徹“預防為主”方針的關鍵措施[9-11]。

在諸多消毒方法中，化學消毒法已成為畜牧生產中最常用的消毒方式[12]。有研究表明，不同消毒劑對布魯氏菌的殺滅效果存在差異[10-11,13-15]，故選擇高效消毒劑是養殖場動物布病防控的重要措施。然而，目前針對布魯氏菌消毒劑的研究相對較少，且多局限于單一種型(羊種、牛種或豬種布魯氏菌)或單一消毒劑，缺乏多種消毒劑對不同種型菌株的系統研究。此外，近年陸續報道犬種布魯氏菌感染家畜和人[16-17]，而對其消毒劑的研究罕見報道。因此，本研究選用戊二醛癸甲溴銨、二氯異氰尿酸鈉、復合酚和過硫酸氫鉀復合粉4種養殖場常用消毒劑，同時對羊種、犬種和豬種布魯氏菌進行消毒效果比較分析，旨在為養殖場選擇消毒劑防控布病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 羊種布魯氏菌活疫苗株(B.melitensisM5)[18]、豬種布魯氏菌活疫苗株(B.suisS2)[18]及犬種布魯氏菌臨床分離株(B.canisY4)[19]均由本實驗室保存。

1.2 消毒劑 復合酚(含酚量41%，含醋酸量22%，批號:20200201)，購自湖南大乘醫藥化工有限公司；戊二醛癸甲溴銨(戊二醛5 g/100 mL，癸甲溴銨5 g/100 mL，批號:20200301)，購自山東圣旺藥業股份有限公司；二氯異氰尿酸鈉(有效氯含量≥20%，批號:2020317)、過硫酸氫鉀復合粉(過硫酸氫鉀含量≥10%，批號:2020318)，均購自四川渴望生物科技有限公司。

1.3 培養基及其他試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(Tryptic soy agar,TSA)(批號:20190526)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(Tryptone soy broth,TSB)(批號:20200815)，均購自青島日水生物技術有限公司；卵磷脂(批號:20200516)、吐溫-80(批號:2020041601)，均購自成都市科隆化學品有限公司；無水硫代硫酸鈉(批號：20191912)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；甘氨酸(批號：191103)，購自西隴科學股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液制備 將羊種、犬種和豬種布魯氏菌接種于TSB培養基中，于37 ℃培養96 h后劃線接種于TSA培養基中，于37 ℃培養72 h。挑取TSA平板上單個典型菌落接種至TSB培養基中，于37 ℃ 培養72 h得到菌懸液，隨后參照文獻[20]進行活菌培養計數(CFU/mL)。

1.4.2 消毒劑配制 根據上述4種消毒劑(戊二醛癸甲溴銨、二氯異氰尿酸鈉、復合酚和過硫酸氫鉀復合粉)產品的推薦使用濃度，用無菌去離子水分別將其倍比稀釋10個濃度梯度。戊二醛癸甲溴銨(以戊二醛癸甲溴銨計)：250.00～0.49 mg/L；二氯異氰尿酸鈉(以有效氯計)：4 000.00～7.81 mg/L；復合酚(以酚計)：17 493.33～34.17 mg/L；過硫酸氫鉀復合粉(以過硫酸氫鉀計)：2 000.00～3.91 mg/L。

1.4.3 最低抑菌濃度(MIC)試驗 參照文獻[20-21]進行最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)試驗。用無菌去離子水將菌懸液稀釋至1×108CFU/mL。分別吸取2.5 mL各稀釋度消毒劑加入到含2.5 mL雙倍濃度TSB培養基的10 mL 離心管中，隨后取0.1 mL稀釋后菌懸液接種于上述含消毒劑的TSB培養基中，作為試驗組。用無菌去離子水代替消毒劑進行上述步驟作為陽性對照。向10 mL離心管中加入2.5 mL無菌去離子水和2.5 mL雙倍濃度TSB培養基作為陰性對照。上述所有樣本于37 ℃培養72 h。

判定標準：3次重復，37 ℃培養72 h后觀察抑菌效果，肉湯渾濁判定為有菌生長即陽性，肉湯清澈判定為無菌生長即陰性。陽性對照應渾濁，陰性對照應清澈，否則試驗結果不成立。以無菌生長的消毒劑最低濃度為該消毒劑對相應試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

1.4.4 最低殺菌濃度(MBC)試驗 參照文獻[20,22-25]配制中和劑并進行最低殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC)試驗，復合酚的中和劑為TSB培養基；戊二醛癸甲溴銨為3%吐溫-80、0.3%卵磷脂和0.3%甘氨酸；二氯異氰尿酸鈉為0.1%硫代硫酸鈉；過硫酸氫鉀復合粉為1%硫代硫酸鈉。用無菌去離子水將菌懸液稀釋至5×106CFU/mL。 分別取2.5 mL各稀釋度消毒劑加入至10 mL離心管中，隨后加入2.5 mL稀釋后菌懸液混勻并立即計時，室溫作用3、10 min和30 min后分別取出500 μL菌液-消毒劑混合液至4.5 mL含中和劑TSB培養基中，經中和作用10 min后取出500 μL 菌液-消毒劑-中和劑混合液至4.5 mL TSB培養基中，作為試驗組。以無菌去離子水代替消毒劑進行上述步驟作為陽性對照，以無菌去離子水代替消毒劑和菌懸液進行上述步驟作為陰性對照。上述所有樣本于37 ℃培養72 h。

判定標準：3次重復，37 ℃培養72 h后觀察殺菌效果，肉湯渾濁判定為有菌生長即陽性，肉湯清澈判定為無菌生長即陰性。陽性對照應渾濁，陰性對照應清澈，否則試驗結果不成立。以無菌生長的消毒劑最低濃度(菌液10 000 g離心2 min，取沉淀于TSA 37 ℃培養3～7 d后無菌落生長)為此消毒劑在該時間內對相應試驗菌株的最低殺菌濃度(MBC)。

2 結果

2.1 4種消毒劑對3株布魯氏菌的MIC 由表1可知，復合酚在17.08、17.08 mg/L和34.17 mg/L即可分別抑制羊種布魯氏菌(M5)菌株、犬種布魯氏菌(Y4)菌株和豬種布魯氏菌(S2)菌株生長，遠低于其產品推薦使用濃度最低值。過硫酸氫鉀復合粉作用于所有受試菌株的MIC也均低于其推薦使用濃度。然而，當戊二醛癸甲溴銨作用于S2菌株以及二氯異氰尿酸鈉作用于Y4菌株和S2菌株時，其MIC則介于相應產品推薦使用濃度最高值和最低值之間。

表1 4種消毒劑對3株布魯氏菌的MIC結果Table 1 MIC results of four disinfectants against three Brucella spp. (mg/L)

2.2 4種消毒劑對3株布魯氏菌的MBC 由表2可知，7.81 mg/L戊二醛癸甲溴銨作用3 min即可殺滅羊種布魯氏菌(M5)菌株，但該消毒劑對犬種布魯氏菌(Y4)和豬種布魯氏菌(S2)菌株的MBC均高于其產品推薦使用濃度最低值，并表現為MBC隨作用時間縮短而明顯增大。二氯異氰尿酸鈉對3株試驗菌株的MBC均低于該消毒劑推薦使用濃度最低值，其中M5菌株對該消毒劑敏感性最高，其次為Y4菌株和S2菌株。類似地，復合酚對3株試驗菌株的MBC均遠小于其推薦使用濃度最低值，17.08 mg/L作用3 min即可殺滅M5菌株和Y4菌株，而S2菌株的MBC稍高于上述兩者。此外，125.00 mg/L和250.00 mg/L過硫酸氫鉀復合粉作用3 min即可分別殺滅M5菌株和Y4菌株，低于其推薦使用濃度。然而，該消毒劑500.00 mg/L濃度作用3 min才可殺滅S2菌株。

表2 4種消毒劑對3株布魯氏菌的MBC結果Table 2 MBC results of four disinfectants against three Brucella spp. (mg/L)

3 討論

消毒是養殖場防控布魯氏菌病的常用方法，選擇高效消毒劑殺滅環境中的布魯氏菌對養殖場防控布病具有重要意義[11]。目前，畜牧生產實踐中常用消毒劑主要包括酚類、醛類、酸類、含氯類、過氧化物類、季銨鹽類、醇類、堿類和含碘類消毒劑等，它們作用機制不盡相同，對布魯氏菌的抑菌和殺菌效果也各異[8,22,26]。

本研究選擇4種單一/復合消毒劑，包括上述前6種消毒劑種類，結果表明不同消毒劑對同種布魯氏菌的抑菌/殺菌能力有所差異，而同種消毒劑對不同種布魯氏菌的消毒效果也不盡相同。其中，戊二醛癸甲溴銨屬于醛類和季銨鹽類復合消毒劑，試驗結果表明其對羊種布魯氏菌(M5)菌株的抑菌和殺菌效果明顯，但對犬種布魯氏菌(Y4)菌株和豬種布魯氏菌(S2)菌株的殺菌能力一般，且殺菌效果受作用時間限制。針對S2菌株，該消毒劑15.63 mg/L作用30 min才可將其完全殺滅，與董炳梅等的研究結果一致，即5 mg/L和50 mg/L戊二醛癸甲溴銨對豬種布魯氏菌作用30 min的殺菌率分別為73%和100%[13]。

屬于有機含氯消毒劑的二氯異氰尿酸鈉[27]對3株試驗菌株的MBC(3.91～31.25 mg/L)均低于其推薦使用濃度最低值(100.00 mg/L)，表明其對受試菌株具有較強殺菌能力。然而，董炳梅等研究發現，90 mg/L二氯異氰尿酸鈉對豬種布魯氏菌作用30 min殺菌率僅為67%[13]，這與本試驗結果不符，分析原因可能為消毒劑生產廠家差異或試驗菌株差異。

除上述2種消毒劑外，有研究表明復合酚(酚類和酸類)和過硫酸氫鉀復合粉(過氧化物類)對多種細菌均具有高效滅菌作用，前者1%濃度或后者0.125%濃度(均以原液計)作用10 min即可殺滅大腸桿菌、巴氏桿菌和葡萄球菌[9,28]。然而，目前未見這2種消毒劑對布魯氏菌消毒效果的相關報道。復合酚主要由苯酚和醋酸配伍而成，據報道，苯酚在常規使用濃度(0.5%)下對豬種、牛種、羊種布魯氏菌均不能起到有效的滅菌作用，同時布魯氏菌對酸存在一定的抵抗力[11]。然而，本試驗結果顯示，復合酚對3株受試布魯氏菌的MIC(17.08～34.17 mg/L)和MBC(17.08～136.67 mg/L)均遠小于其推薦使用濃度最低值(1 312.00 mg/L)，其較另3種消毒劑具有最強的抑菌和殺菌能力，表明該消毒劑對不同種布魯氏菌具有廣譜高效的消毒作用，可作為布魯氏菌消毒劑首選。分析原因可能為苯酚與醋酸配伍使用時，前者引起的菌體細胞通透性增加、細胞內組分泄露協同后者導致的菌體蛋白變性共同產生了高效消毒能力[9,22]。

過硫酸氫鉀復合粉是由過硫酸氫鉀、硫酸鉀和硫酸氫鉀以一定比例組合而成的一種基于酸性體系的新型氧化類消毒劑[24,29]。結果顯示其對M5菌株和Y4菌株的抑菌和殺菌效果均較好，相應MIC和MBC均小于推薦使用濃度，而對S2菌株的MBC則高于前2種菌株，表明過硫酸氫鉀復合粉對豬種布魯氏菌試驗株的消毒效果遜于羊種和犬種布魯氏菌試驗株。

本研究結果表明，同種布魯氏菌對不同消毒劑以及不同種布魯氏菌對同一消毒劑的敏感性存在差異，復合酚對羊種、犬種和豬種布魯氏菌的抑菌及殺菌能力最強，消毒效果最佳，二氯異氰尿酸鈉、過硫酸氫鉀復合粉和戊二醛癸甲溴銨次之。生產實踐中推薦復合酚作為養殖場最適合的布魯氏菌環境消毒劑。