生物炭與氮肥配施對植煙土壤微生物及碳氮含量特征的影響

馮慧琳，何歡輝，徐 茜，李小龍，張 帆，姬小明，徐辰生*，任天寶*，劉國順

（1．河南農業大學煙草學院/河南省生物炭研究工程技術中心，河南 鄭州 450002；2．福建省煙草公司南平市公司/南平煙草科學研究所，福建 南平 353000；3．龍巖市煙草公司上杭分公司，福建 龍巖 364200）

土壤健康培育和根際微生物調控是實現農業綠色高質量發展的重要基礎和途徑［1］。生物炭作為一種土壤改良劑具有較強的吸附力、極大的比表面積和發達的孔隙結構，在土壤微生態調控、土壤固碳培肥和緩解溫室效應等方面具有良好的效應［2-5］。土壤微生物是土壤生態的重要組成部分，微生物的數量和新陳代謝的變化都會直接作用于土壤，使土壤養分及結構發生改變［6-7］。Prayogo等［8］研究發現生物炭能夠改變土壤微生物定殖棲息地的理化性質，從而改變土壤微生物的群落結構。同時Ameloot等［9］也發現生物炭能夠為土壤微生物提供一個舒適的棲息環境，刺激土壤微生物發生改變。

氮是植物必需的營養元素之一，是限制作物產質量的重要因子，氮肥施用過多或不足均會對土壤及環境造成不良影響［10-12］。近年來有大量研究表明，生物炭能夠提升土壤氮素利用率［13-14］，Wang等［15］研究發現生物炭增加了土壤中有效氮、磷、鉀的含量，改變了土壤物理結構，促進了烤煙根系的健康發展。Oladele等［16］研究發現生物炭與氮肥配施能夠減少硝酸鹽的淋失、提高水稻產量和土壤養分的有效性。Chaplot等［17］研究證明基于山核桃生產的生物炭能夠減少土壤中硝酸鹽的浸出。因此，人們把目光聚集在生物炭與氮肥減施上，以期探究出最有利于土壤健康和可持續性發展的精準施肥模式。沈仁芳等［18］提出，土壤研究已經從單一的生產功能研究階段進入到生產、環境、生態多目標多功能系統的研究階段。本研究基于土壤健康、土壤微生態環境發展的角度，在邵武煙區深入開展植煙土壤施加生物炭并采取減氮措施試驗，從土壤-根系-微生物互作過程對植株養分高效利用的影響入手，以期為我國植煙土壤健康培育和綠色農業發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2018年2～10月在福建省南平市邵武市沿山鎮進行，該煙區為煙稻輪作，植煙土壤均為砂壤土，土壤基本理化性質見表1。試供烤煙品種為K326，由福建省南平市邵武市公司提供。試驗小區選擇有代表性、前茬作物一致、土壤肥力均勻、肥力中等水平的地塊。生物炭由河南省生物炭工程技術研究中心提供，原材料為花生殼，在380～400℃條件下低氧、連續炭化5～6 min制得，粉碎后過篩（孔徑2.00 mm），其基本理化性質見表2。

表1 土壤基本理化性質

表2 生物質炭基本理化性質

1.2 試驗方法

試驗設一個空白對照、一個常規施肥、4個不同生物炭用量配合不同程度的減氮處理，每個處理重復3次，6個處理具體的施肥配比及小區面積見表3。空白對照CK1不施加任何肥料，CK2按照當地常規施肥模式為：煙草專用肥525 kg/hm2（N：12.5%，P2O5：8.0%，K2O：22.5%）、芝麻餅肥675 kg/hm2（N：5.8%，K2O：1.3%）、鈣鎂磷肥459 kg/hm2、氫氧化鎂187.5 kg/hm2、硝酸鉀345 kg/hm2、硫酸鉀300 kg/hm2，氮、磷、鉀比例為1∶0.78∶2.87。施肥處理的氮肥基、追肥比例為7∶3（70%作為基肥，30%作為追肥），基肥采用條施，追肥于移栽后30 d施用。

表3 試驗處理設計

該試驗于2月23日進行煙田整地、施肥及起壟工作，所有物料于起壟前一天條施，施用生物炭后，將其他物料混勻后撒施于生物炭上。煙苗于3月4日進行移栽，采用膜下移栽方式，5月8日開始逐一打頂，5月18日開始進行煙葉采烤。該試驗區煙葉于7月11日全部采收完，7月27日煙葉全部烘烤完畢。

1.3 土壤養分及碳、氮含量分析方法

在煙株移栽后45、60、75、90 d時，根據5點取樣法確定取樣點，用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中煙株的任何側根，挖出煙株整個根部。將根球放入盆中，搖動根部，用鏟子從根部去除土壤，采集盆中的土壤放入密封袋中，常溫避光條件下風干、磨細、過篩，進行土壤樣品分析。測定方法參照文獻［19］，有效磷測定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀測定采用0.5 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法；堿解氮測定采用堿解擴散法；稱取過0.149 mm篩的風干土樣20 mg，采用 VarioEL III 型元素分析儀測定樣品中的全碳含量。

1.4 土壤微生物分析方法

在煙株移栽后75 d時，根據5點取樣法確定取樣點，用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中煙株的任何側根，挖出煙株整個根部。將根球放入盆中，搖動根部，用鏟子從根部去除土壤，采集盆中無碎塊的土壤5～10 g，除去植物根、動物殘骸及其他雜質，混勻過2 mm篩，保存在10 mL無菌離心管中，用干冰保存送往上海美吉生物科技有限公司，對采集的土壤樣品進行土壤微生物多樣性檢測。

土壤DNA提取和PCR擴增：用E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross GA USA）提取總DNA，DNA的濃度和純度利用NanoDrop2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司）來進行檢測，DNA提取質量利用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測；細菌16S rRNA用338F（5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′）引物對V3～V4可變區進行PCR擴增，真菌18S用SSU0817F（5′-TTAGCAT GGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTG GACCTGGTGAGTTTCC-3′）引 物 對V5～V7可 變區進行PCR擴增［20］，擴增的程序為：95℃預變性3 min，27個循環（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型）。擴增體積為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmoL dNTPs，0.8 μL引物（5 Um），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

Illumina Miseq測序：PCR產物用2%瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫，構建文庫步驟：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。

1.5 統計方法

采用Excel 2016分析數據，用DPS 7.0分析處理數據，方差分析采用最小顯著性差異法。微生物處理使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序 列 進 行Operational Taxonomic Units（OTUs）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifie對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123），設置比對閾值為70%。韋恩圖分析時選用相似水平為97%的OTUs的樣本表，利用R語言進行統計和作圖。可視圈圖利用Circos-0.67-7軟件。Qiime計算beta多樣性距離矩陣，R語言vegan軟件包進行NMDS分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 生物炭與氮肥配施對土壤有效磷、速效鉀、堿解氮含量的影響

有效磷是土壤中可被植物吸收的磷組分，能夠促進植物早期根系的形成和生長，提高植物適應外界環境的能力，可增強植物的抗旱性及抗寒性。從圖1可以看出，各處理的有效磷含量隨著生育期的增加而減少，在移栽后75 d生物炭與減氮處理的有效磷含量高于CK2處理。在移栽后90 d時差異最明顯，T1至T4的有效磷含量與CK2相比分別增加了31.81%、47.15%、82.22%、32.87%。說明生物炭與減氮處理能夠增加土壤中的有效磷含量，且以T3處理增幅最大。

煙株對鉀素的吸收是在烤煙生長發育的早期，因此保證早期的鉀素供應是十分必要的。從圖2可以看出，T4處理在煙草移栽后60 d時土壤中速效鉀的含量最大，達276.87 mg/kg，顯著高于未加生物炭的處理。T4處理在煙草的4個生育期里，土壤速效鉀含量都顯著高于CK2，分別顯著增加了11.89%、35.11%、25.95%、15.85%。說明生物炭與減氮處理能夠在煙株生長前期保證土壤中鉀素含量以供煙葉吸收。

土壤中的堿解氮含量能夠反映煙株對氮素的吸收、利用情況，堿解氮含量的提升會使土壤的供氮能力增強，能夠滿足煙株對氮素的需求，促進植株對養分的吸收。從圖3能夠看出，生物炭與減氮處理能夠提升土壤堿解氮的含量，其中移栽后45、60、75 d以T3處理的堿解氮含量最大，移栽后45 d含量為187.92 mg/kg，較CK2處理增加了16.66%。4個生物炭配合減氮處理在移栽后90 d時均與CK2處理存在顯著性差異，分別較CK2處理增加了7.21%、8.03%、12.41%、12.76%。

2.2 生物炭與氮肥配施對土壤全碳含量及土壤碳氮比的影響

在煙草生長前期，常規施肥與生物炭配合減氮處理部分存在顯著性差異，但隨著生長期的增加，差異越來越不顯著，到成熟期時，各處理間的全碳含量不存在顯著性差異。由圖4可以看出，移栽后45 d時，T1至T4的全碳含量較CK2分別增加了1.29%、3.89%、12.44%、5.62%。在整個煙草生育期中T3處理土壤的全碳含量一直高于其他處理，除移栽后90 d與CK2不存在顯著性差異外，其它3個時期均與CK2差異顯著，且4個時期較CK2分別增加了12.44%、18.48%、16.58%、6.15%。所以在土壤中施加生物炭與減氮處理會使土壤全碳含量在煙草生育前期有所增加，且以T3處理效果最佳。

由圖5可以看出，施用生物炭能夠提升土壤碳氮比，生物炭高添加量的提升作用大于低添加量。隨著煙草生育期的增加，各處理之間土壤碳氮比差距減少。從煙草整個生育期來看，T3、T4處理的土壤碳氮比始終與CK1、CK2處理存在顯著性差異，且4個時期T4處理較CK2處理分別增加了5.44%、4.85%、2.57%、4.18%。

2.3 生物炭與氮肥配施對土壤微生物的影響

2.3.1 土壤微生物樣本測序的結果

所有樣本真菌測序共獲得1523483條有效序列，細菌測序共獲得1581998條有效序列。由圖6（a）能夠看出，細菌中所有樣本所共有的OTUs總數為1715，CK1、CK2、T1、T2、T3、T4處理所特有的OTUs數目分別為59、35、19、3、7、3。由圖6（b）能夠看出，真菌中所有樣本所共有的OTUs總數為161，CK1、CK2、T1、T2、T3、T4處理所特有的OTUs數目分別為6、1、4、5、2、4。總的來說，生物炭與氮肥配施處理較CK1、CK2處理在細菌中的差異較大。

2.3.2 土壤微生物物種組成

不同樣本中優勢菌種的組成是相似的，但是每一菌種在每一樣本中所占的比例是完全不同的。通過可視化圈圖來展現每個處理中優勢物種的分布比例及各優勢物種在不同處理中的分布比例。由圖7（a）可以看出，土壤細菌的優勢菌綱是放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線桿菌綱（Ktedono-bacteria）和酸桿菌綱（Acidobacteria）。4個生物炭配合減氮處理的放線菌綱相對豐度較CK2處理分別減少了16.67%、11.11%、22.22%、5.56%，4個生物炭配合減氮處理的酸桿菌綱相對豐度較CK2處理分別減少了18.75%、0.00%、11.11%、11.11%，說明生物炭與減氮處理會減少放線菌綱（Actinobacteria）及酸桿菌綱（Acidobacteria）的相對豐度。T2處理的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）相對豐度最高，較CK1、CK2處理分別增加了23.53%、9.52%。由圖7（b）可以看出，土壤真菌的優勢菌綱為糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、子囊菌門某綱（norank_p_Ascomycota）。T1處理的糞殼菌綱（Sordariomycetes）相對豐度最高，較CK1、CK2處理分別增加了29.41%、15.79%。各處理散囊菌綱（Euroti om ycetes）相對豐度大小排列為：T2>CK1>T3>T4>T1=CK2，說明常規施肥會降低土壤中散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對豐度，但是通過生物炭與氮肥配施能夠減緩降低作用，使其相對豐度提升，隨著生物炭用量和減氮比例的增加，散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對豐度呈現先增加后減少的趨勢。子囊菌門某綱（norank_p_Ascomycota）的相對豐度隨著生物炭用量和減氮比例的增加，呈現先減少后增加的趨勢，到T3處理相對豐度達到最低，T4處理的相對豐度最高，較CK2處理增加了86.67%。

2.3.3 土壤微生物β多樣性

基于Bray-Curtis距離對6個處理的土壤細菌群落組成進行NMDS分析。由圖8（a）能夠看出CK1的土壤細菌群落與其余5個處理存在明顯差異，T3、T4處理的土壤細菌群落組成更加相似。由圖8（b）可知，T2、T3、T4處理的土壤真菌群落更加相似，與T1處理存在明顯差異，說明生物炭用量和減氮比例的增加會導致土壤微生物真菌群落結構發生變化；與CK1、CK2處理也存在明顯的差異，說明生物炭與氮肥配施會影響土壤微生物真菌菌群結構。

3 討論

3.1 生物炭與減氮措施配合對土壤養分及碳含量的影響

生物炭本身的養分含量很低，但因其獨特的物理特性，如較高的比表面積和較大的孔隙度，能夠吸附土壤中的氮、磷、鉀元素，減少它們的淋失［21］。由上述結果來看，植煙土壤中施入生物炭會改變土壤的養分情況，添加生物炭后能夠提高土壤有效磷、速效鉀的含量，Laird等［22］研究發現生物炭的孔隙結構對肥料養分的延長釋放有作用，能夠降低養分損失，增加土壤磷鉀的有效性，與本文的研究結果相印證。但本試驗會出現生物炭施用量大的處理有效磷含量小的情況，如移栽后90 d時，T3處理的有效磷含量大于T4處理。張阿鳳等［23］的研究表明，適宜用量的生物炭不僅能夠減少土壤有效磷的淋溶和固定，還可以吸附一部分的磷酸根，使得土壤有效磷含量增加幅度較大；但是過高用量生物炭對土壤的影響僅以吸附土壤的磷酸根為主，因此會導致有效磷含量增幅小，與本文的研究結果相印證。本研究中隨著生物炭施用量的增加土壤中速效鉀的含量也增加，這與前人的研究基本一致［24］。并且，這與生物炭能夠提高土壤持水性有關，聶新星等［25］研究發現，土壤水分狀況是影響土壤鉀素固定和釋放的重要因素，生物炭施入土壤后能夠通過提高土壤持水能力從而影響土壤鉀素含量。本研究發現生物炭能夠增加土壤中的全碳含量及碳氮比，這與前人的研究相似［26］，且發現全碳和碳氮比均隨著生物炭用量和減氮比例的增加呈現先增加后減少的趨勢，進一步證實了生物炭能夠保持土壤中的有機質不被降解和淋溶，且因其性質穩定施加到土壤中能夠有助于土壤中腐殖質的形成，從而增加碳含量［27］。劉玉學等［28］研究表明，生物炭對NH4+、NO3-具有較強的吸附作用，因此土壤中添加生物炭能夠減少氮素的淋溶，增加土壤中的氮素含量。對比CK2處理，生物炭處理能夠增加土壤中的堿解氮含量，且存在顯著性差異，與梁忠厚等［21］的研究結果相同。但是較高生物炭施用量及減氮的T4處理堿解氮含量卻小于T3處理，主要原因是過量生物炭聚集在植株根際土壤區域，土壤微生物活性受到抑制，降低土壤氮素的有效性，從而表現為土壤氮含量的降低。

3.2 生物炭與減氮措施配合對土壤微生物的影響

土壤微生物是土壤中氮、碳等營養元素循環與轉化的動力源泉，會通過降解凋落物等有機物質，釋放植物能夠利用吸收的養分，從而幫助土壤保持有效肥力［29-31］。從土壤微生物的韋恩圖和NMDS分析圖可以看出，生物炭與減氮措施配合對土壤細菌的影響大于對土壤真菌的影響。可能與生物炭能夠提高土壤的pH［32］有關，一般有利于細菌繁殖的土壤pH高于有利于真菌繁殖的土壤pH［33］。施用生物炭對土壤微生物的群落結構會產生一定的影響，生物炭與氮肥配施處理較CK2處理增加了α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）和子囊菌門某綱（norank_p_Ascomycota）的相對豐度。有研究表明生物炭具有獨特的結構且含有豐富的營養物質，能夠為土壤微生物提供一個更好、更舒適的棲息環境，能夠刺激土壤微生物的相對豐度發生改變，有利于某些細菌、真菌的生長，與本文研究結果相印證［32］。本文也發現生物炭與氮肥配施處理較CK2處理放線菌綱（Actinobacteria）及酸桿菌綱（Acidobacteria）的相對豐度減少，可能是由于本文的生物炭與氮肥配施處理采用了減少氮肥的措施，導致土壤中的氮素較CK2沒有那么的充足而不能很好地支撐某些細菌的生長代謝過程，從而引起某些細菌相對豐度的降低［34］，不過放線菌綱（Actinobacteria）多為致病菌，該菌的減少會降低土壤病害的發生概率，從而更加有利于土壤健康。

4 結論

生物炭與減氮處理能夠在煙草的生長過程中改變植煙土壤的養分情況，適當減氮與生物炭的添加能夠促進土壤碳氮平衡，改變土壤微生物的群落結構，使土壤向一個更加健康的環境改變，表明生物炭能夠滿足我國植煙土壤改良的同時還能實現農業“雙減”，對烤煙實施肥料減施、有機肥替代部分無機肥的施肥措施提供理論依據。綜上所述，以T3（常規施肥+氮肥80 kg/hm2+生物炭1350 kg/hm2）模式對土壤動態養分的影響最符合烤煙不同生育期養分需求，有利于土壤健康、土壤培育和植物根際土壤微生物調控。