木霉P3.9菌株對枇杷根際真菌多樣性及其群落組成的影響

魯海菊，李曉靜，謝欣悅，沈云玫，陶宏征

（紅河學院生命科學與技術學院，云南 蒙自 661199）

枇杷內生木霉（Trichodermasp.）P3.9菌株抗菌譜廣［1］，發酵工藝簡單［2-3］，能抑制枇杷根腐病菌［4］，且能成功定殖于枇杷根際［5］及其植株內［6］，并能抑制枇杷根際土壤真菌［7］及枇杷內生真菌［8］，促進枇杷根際細菌生長［9］。對枇杷植株有促生防病［6］作用，具有廣闊的開發應用前景。

隨著高通量測序技術的發展［10］，植物未培養病菌得以檢測［11］，明確了黃豆發霉優勢病菌為Fusarium moniliforme［12］。黃 連［13］、枸 杞［14］、人參［15-17］、丹參［18］、重樓［19］、茶［20］等中藥，榨菜［21］、馬鈴薯［22］等蔬菜，草莓［23］、臍橙［24］、葡萄［25］等果樹根際土壤真菌多樣性狀況不斷得到揭示，根腐病發病機理研究進一步深入。發現黃連根腐病株鐮刀菌屬含量顯著高于健康植株［13］，榨菜根腫病重病田土壤病原真菌數量增加［21］。菌根菌Glomus intraradices內球囊霉［26］處理，可以顯著提高草莓根際土壤有益真菌，減少致病真菌種類。土壤中添加納米銀［27］、生物炭［22，28］、環保肥料［29］等物質能改善植物根際土壤真菌群落結構。土壤微生物群落結構已成為判斷土壤是否健康的生物指標［30］。通過科學耕作，管理根際土壤微生物豐度來實現農業可持續發展，將是一種不錯的選擇［31-32］。為進一步明確木霉P3.9菌株對枇杷根腐病的防病促生機理，本研究利用Illumina平臺，對添加木霉P3.9菌株的處理和未添加對照枇杷根際土壤真菌進行高通量測序，分析其對枇杷根際真菌多樣性及群落組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

內生木霉P3.9菌株（Trichoderma atroviride）分離自枇杷主干韌皮部，保存于紅河學院生命科學與技術學院植物病理學標本室。

1.1.2 供試培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來水1000 mL；pH 7.0。

在121℃高壓滅菌30 min。材料均購自農貿市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌懸液接種于根際土壤的方法

將試管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落長滿全皿后，用打孔器取5 mm的菌餅，接入PDA平板中央。共培養5皿，置28℃培養5～7 d；待菌落長滿全皿后，收集所有培養物至粉碎機，并加入適量無菌水，充分打勻，制成菌懸液，調整孢子濃度至1×106cfu/mL備用。枇杷嫁接苗種植于營養袋（23 cm×18 cm）中，苗齡為1年時做接種試驗。用上述木霉孢子懸浮液灌根，500 mL/株，灌根等量清水做為對照，設10個重復，常規肥水管理。

1.2.2 枇杷根際土樣采集

灌根木霉孢子懸浮液第10、20、30、40、50、60、70、80、90 d，用不銹鋼環刀土鉆，高0.5 m，鉆頭直徑38 mm；處理和對照枇杷苗分別隨機取3株，每株用5點取樣法，采集深度5～20 cm的根際土樣，除去枯枝落葉，過0.075 mm篩，用四分法充分混勻土樣備用。每個處理取3個重復送檢。

1.2.3 枇杷根際土壤總DNA提取

用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒，按說明提取。

1.2.4 設計并合成引物接頭

根據illumina Miseq高通量測序要求，進行雙向測序，設計目標區域和帶有“5′Miseq接頭-barcode-測序引物-特異引物-3′”的融合引物。

F 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACbarcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3′；

R 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATbarcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAAT TCCA-特異引物-3′。

1.2.5 PCR擴增和產物純化定量及均一化

采用兩步PCR擴增的方法，使用ABI9700PCR儀，一次PCR擴增體系：5xBuffer 10μL，dNTP（10 mmol/L）1μL，Phusion超保真DNA聚合酶1 U，F/R內側引物（10 μmol/L）各1μL，模板5～50 ng，ddH2O補至50μL。一次PCR擴增程序：94℃ 2 min預變性，94℃ 30 s變性，50～56℃ 30 s退火，72℃30 s擴增，72℃ 5 min延伸，10℃保溫，25～35個循環。二次PCR擴增體系：5xBuffer 8μL，dNTP（10 mmol/L）1μL，Phusion超 保 真DNA聚 合 酶0.8U，F/R外側引物（10 μmol/L）各1μL，模板5 uL，ddH2O補至40μL。二次PCR擴增程序：94℃2 min預變性，94℃ 30 s變性，56℃ 30 s退火，72℃ 30 s擴增，72℃ 5 min延伸，10℃保溫，8個循環。

將PCR擴增產物，于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收（電泳槽保持干凈，更換電泳緩沖液）。采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收。回收產物進行qPCR定量。采用FTC-3000TM real-time PCR儀對膠回收產物進行定量。

1.2.6 MiSeq高通量測序

54個樣品送微基生物科技（上海）有限公司測序。

1.2.7 數據統計

1.2.7.1 Operational Taxonomic Units（OTU）聚類 使用USEARCH和mothur去除沒有注釋結果的OTU，去除注釋結果不屬于分析項目中的物種。

通 過mothur（classify.seqs）將OTU代 表 序列與數據庫比對進行物種注釋，置信度閾值設置為0.8。

1.2.7.2 群落結構組成韋恩圖 選用相似水平為97%的OTU樣品表，用mothur和R語言作圖。

1.2.7.3 基于OTU的PCA分析 使用97%相似度的OTU，用mothur作圖。

1.2.7.4 群落結構組成柱狀圖 基于每個樣品在每個OTU的豐度統計表，利用R語言工具作圖。

1.2.7.5 Anova_oneway組間差異比較 選擇P<0.05的物種繪制柱形圖，每個柱子為差異物種的相對豐度，誤差線為標準誤，其中*代表0.01

2 結果與分析

2.1 引入木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌多樣性及群落豐度的影響

由表1可知，枇杷根際土壤中引入木霉P3.9菌株10～90 d之間，根際土壤真菌ACE、Chao、香農和辛普森指數與不引入木霉P3.9菌株的對照差異不顯著。說明木霉P3.9菌株不影響枇杷根際土壤真菌群落豐度和群落多樣性。

表1 木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌多樣性及群落豐度的影響

2.2 引入木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌群落數量的影響

由圖1可知，枇杷根際引入木霉P3.9菌株處理與未引入對照共有的根際真菌有1304種，引入木霉P3.9菌株處理枇杷根際土壤獨有的根際真菌有588種，未引入木霉對照獨有的根際真菌有590種。說明枇杷根際引入木霉P3.9菌株能抑制土著真菌生長，導致枇杷根際真菌數量減少2種，因此枇杷根際真菌群落組成發生變化。

2.3 引入木霉P3.9菌株對枇杷根際真菌多樣性的持續影響

由圖2可知，枇杷根際土壤引入木霉P3.9菌株之后，PC1值為42.05%，表示不同取樣時間檢測枇杷根際真菌群落差異可以解釋全面分析結果的42.05%。在引入木霉P3.9菌株10～30 d之間，引入木霉的處理和未引入對照在PCA坐標圖上幾乎聚集在一起；40～90 d之間，引入木霉的處理和未引入對照在PCA坐標圖上分散開來。說明引入木霉P3.9菌株30 d之內，枇杷根際真菌群落幾乎未發生改變；40～90 d之間，枇杷根際真菌群落組成發生改變。

2.4 引入木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌群落組成的影響

2.4.1 引入木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌群落屬分類地位的影響

由圖3可知，枇杷根際土壤真菌注釋到58個已知屬，其中物種豐度占前15位的依次為Fusarium、Mortierella、Trichoderma、Chaetomium、Gibberella、Ilyonectria、Phoma、Monographella、Fusicolla、Cladosporium、Acremonium、Aspergillus、Lasiodiplodia、Stephanonectria、Lectera。由 圖4可知，引入木霉P3.9菌株處理與未引入對照枇杷根際土壤真菌，在屬分類水平上物種豐度差異顯著。導致枇杷根際土壤真菌注釋到的15個已知屬物種豐度發生改變。物種豐度占前15位的優勢屬中，有5個屬物種豐度發生改變，占比達1/3。其中優勢屬Mortierella極顯著增加（0.001

2.4.2 引入木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌群落種分類地位的影響

由圖5可知，枇杷根際土壤真菌注釋到49個已知種，其中物種豐度占前20位的依次為Fusarium brachygibbosum、Ilyonectria macrodidyma、Mortierella alpina、Phoma omnivirens、Monographella cucumerina、Fusicolla acetilerea、Acremonium antarcticum、Stephanonectria keithii、Penicillium neocrassum、Penicillium citrinum、Podospora communis、Sarocladium strictum、Purpureocillium lavendulum、Penicillium virgatum、Metacordyceps chlamydosporia、Mortierella exigua、Clonostachys rosea、Subulicystidium perlongisporum、Hyaloseta nolinae和Clonostachys miodochiali。由 圖6可 知，引入木霉P3.9菌株處理與未引入對照枇杷根際土壤真菌，在種分類水平上差異顯著，導致枇杷根際土壤真菌注釋到的14個已知種物種豐度發生改變。物種豐度占前20位的優勢種中，有4個種物種豐度發生改變，占比為1/5。其中優勢種Mortierella alpina和Mortierella exigua顯著增加（0.01

3 討論

枇杷根際土壤引入木霉P3.9菌株對枇杷根際真菌多樣性無不良影響，但對其真菌群落組成影響顯著，導致根際真菌減少2個種。從屬水平分析，被孢霉屬Mortierella、木霉屬Trichoderma、蠟蚧菌屬Lecanicillium增加，裂殼屬Schizothecium、莖點霉屬Phoma、曲霉屬Aspergillus、Lectera、柄孢殼菌屬Podospora減少；從種水平分析，Mortierella alpina、Mortierella exigua、Penicillium decumbens和Lecanicillium primulinum增加，Penicillium citrinum和Coprinus phaeopunctatus、Phoma omnivirens、Acremonium fusidioides、Cryptocossus podzolicus、Aspergillus proliferans、Leptodiscella chlamydospora和Penicillium menonorum減少。據報道，大興安嶺地區土壤優勢真菌為被孢霉屬［33］。被孢霉屬［34］真菌可以排斥和抑制其它土壤微生物［35］，高山被孢霉M. alpina能產生倍半萜類化合物［36］，具有抑菌作用。長期施有機肥，玉米根際土壤被孢霉屬數量急劇增加［37］，與本研究結果一致。被孢霉在土壤養分濃度提升過程中貢獻最大，能產生抗生素，調控玉米根際激素水平，對玉米有促生防病作用［37］。添加被孢霉能修復三七連作土壤真菌群落，預防三七根腐病［38］。斜臥青霉菌Penicillium decumbens［39］有溶磷作用，對玉米有促生作用。蠟蚧菌屬大多為昆蟲寄生真菌，能寄生于柑橘木虱［40］，從而減輕柑橘黃龍病發生。說明引入木霉P3.9菌株能促使枇杷根際土壤有益真菌增加，增強枇杷根際土壤肥力及抑菌作用，對枇杷植株起到促生防病作用，此結論與筆者前期研究結果一致［6］。莖點霉屬Phoma真菌能引起核桃樹腐爛病［41］，葡萄莖枯病［42］；曲霉屬Aspergillus真菌能引起棗果［43］、生菜［44］腐爛病、煙葉霉變［45］；Penicillium citrinum能引起柑橘采后腐爛病［46］，說明引入木霉P3.9菌株能促使枇杷根際土壤病原真菌減少。綜上所述，木霉P3.9菌株對枇杷根際土壤真菌群落結構有改善作用，有益真菌數量增多，有害真菌數量減少，對連作枇杷根際土壤有潛在修復作用。

4 結論

枇杷根際引入木霉P3.9菌株不會改變枇杷根際土壤真菌群落多樣性，改變了根際真菌群落組成。有益真菌物種豐度增加，有害真菌物種豐度減少，對枇杷連作根際土壤有潛在修復作用。

枇杷根際引入木霉P3.9菌株可以促進Mortierella alpina和Mortierella exigua生長，對枇杷根際土壤肥力有提升作用。

綜上，枇杷內生木霉P3.9菌株對枇杷植株具有促生防病作用，應用前景廣闊。