LncRNA SNHG14/miR?148a?3p/PODXL軸在瘢痕疙瘩形成過程中的分子機制

李嫚 溫曉東 張立燕 劉軍

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四一醫院燒傷整形科（西寧810007）

瘢痕疙瘩是臨床常見的一種皮膚纖維化疾病，其主要特征為成纖維細胞增殖過度與膠原等細胞外基質沉積過度，目前瘢痕疙瘩形成的分子機制尚未闡明，且缺乏有效治療藥物，手術切除后患者復發率較高且預后較差，因而探究瘢痕疙瘩的形成機制對尋找其有效治療靶點具有重要意義［1-5］。LncRNA 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達上調或下調，并可參與瘢痕疙瘩形成過程［6-10］。LncRNA SNHG14 在宮頸癌中表達水平升高，其高表達量與患者預后不良有關［11］。生物信息學分析顯示SNHG14 與miR?148a?3p 存在結合位點，研究表明miR?148a?3p 在食管癌中表達水平降低，上調其表達可通過靶向DNMT1 抑制食管癌細胞增殖及轉移［12］。生物信息學分析顯示miR?148a?3p與Podocalyxin 樣 蛋 白（podocalyxin?like protein，PODXL）存在結合位點，PODXL 屬于唾液酸糖蛋白且屬于CD34 家族成員，研究表明PODXL 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達量升高，下調其表達可明顯誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡，并可抑制細胞增殖［13］。因此，本研究主要探討SNHG14 是否可通過靶向調控miR?148a?3p/PODXL 軸而參與瘢痕疙瘩形成過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑研究對象為2018年2月至2020年3月診治的42 例皮膚瘢痕疙瘩患者，所有患者均經病理組織學檢查確診為瘢痕疙瘩，均為首次診治的患者；未合并其他皮膚疾病或惡性腫瘤，其中男22例，女20例，年齡（38.56±3.65）歲。選取同期42 例良性皮膚疾病（皮膚外傷或植皮）患者為對照，其中男28 例，女14 例，年齡（38.18 ± 5.49）歲。兩組研究對象年齡、性別比較差異無統計學意義，具有可比性。術中切除正常皮膚組織、瘢痕疙瘩組織后于液氮中速凍，然后轉移至-80 ℃冰箱內保存?；颊呋蚱浣H屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。人瘢痕疙瘩成纖維細胞購自中科院上海細胞庫；DMEM 培養基購自美國Gibco；胎牛血清購自美國Hyclone；雙熒光素酶報告基因檢測購自美國Promega；MTT 試劑、RNA 提取試劑、蛋白提取試劑盒與山羊抗兔IgG 二抗購自武漢博士德生物；Lipofectamine2000、逆轉錄與熒光定量PCR 試劑購自美國Thermo Fisher；si?NC、si?SNHG14、miR?NC、miR?148a?3p mimics、anti?miR?NC、anti?miR?148a?3p 購自廣州銳博生物；Transwell 小室、Matrigel 基質膠購自北京索萊寶；兔抗人PODXL 多克隆抗體購自武漢艾美捷科技；兔抗人ProcollagenⅠ單克隆抗體購自上海遠慕生物；兔抗人α?SMA、Col1 抗體購自美國Pro?teintech。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組瘢痕疙瘩成纖維細胞用DMEM培養基于37 ℃培養箱內培養，待細胞融合度達到70%時用Lipofectamine2000 說明書對瘢痕疙瘩成纖維細胞進行轉染，分別轉染si?NC（si?NC 組）、si?SNHG14（si?SNHG14 組），轉染6 h 后將無血清培養基更換為DMEM 完全培養基繼續培養48 h。

1.2.2 qRT?PCR 檢測SNHG14、miR?148a?3p 的表達水平用RNA 提取試劑盒提取正常皮膚組織、瘢痕疙瘩組織與各組瘢痕疙瘩成纖維細胞的總RNA，用cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉錄合成cDNA，以2 μL cDNA 為模板，用SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒進行qPCR 擴增，SNHG14 以GAP?DH 為內參，miR?148a?3p 以U6 為內參，用2?ΔΔCt法計算SNHG14、miR?148a?3p 的相對表達量。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖收集各組處理后的瘢痕疙瘩成纖維細胞，每孔分別加入20 μL MTT溶液，于37 ℃培養箱內培養4 h，棄培養液，每孔分別加入150 μL DMSO，室溫振蕩溶解5 min，用酶標儀檢測各孔OD值（490 nm）。

1.2.4 平板克隆形成實驗各組瘢痕疙瘩成纖維細胞培養2 周后收集細胞，預冷PBS 洗滌，用5%甲醛固定30 min，PBS 洗滌，用0.1%結晶紫染色液染色30 min，PBS洗滌，晾干后于顯微鏡下計數≥50個細胞的菌落數量。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲轉染后的各組瘢痕疙瘩成纖維細胞（1 × 106個/mL）分別加入預先鋪制Matrigel 基質膠稀釋液（侵襲實驗）或未鋪制Matrigel 基質膠稀釋液（遷移實驗）的小室的上室（200 μL/孔），其中重懸細胞所用培養基均為不含血清的培養基，小室的下室中分別加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養液，于37 ℃培養箱內培養24 h 后取出小室，PBS 洗滌后多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，于顯微鏡下計數。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測SNHG14 與miR?148a?3p 的靶向關系，以及miR?148a?3p 與PODXL的靶向關系將pmirGLO?WT?SNHG14與pmirGLO?MUT?SNHG14 分別與miR?148a?3p mimics 或其陰性對照（miR?NC）在Lipofectamine2000 的介導下共轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞，48 h 后用雙熒光素酶報告基因系統檢測細胞中的熒光素酶活性。將pmirGLO?WT?PODXL 與pmirGLO?MUT?PODXL 分別與miR?148a?3p mimics 或其陰性對照（miR?NC）在Lipofectamine2000 的介導下共轉染至瘢痕疙瘩成纖維細胞，48 h 后用雙熒光素酶報告基因系統檢測細胞中的熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測PODXL、ProcollagenⅠ、α?SMA、Col1 蛋白表達用蛋白提取試劑盒提取瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織以及各組瘢痕疙瘩成纖維細胞總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，SDS?PAGE分離蛋白，將其轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，加入稀釋的PODXL（1∶1 000）、

Procollagen Ⅰ（1∶800）、α?SMA（1∶600）、Col1（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，加入稀釋的二抗（1∶2 000）室溫下孵育PVDF 膜1 h，ECL 顯色試劑盒顯影，ImageJ 軟件分析目的條帶與內參GAPDH 條帶灰度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，計量資料以（）表示且均符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；Pearson 法檢測瘢痕疙瘩組織中SNHG14 與miR?148a?3p 的相關性，以及miR?148a?3p 與PODXL 的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中SNHG14、miR?148a?3p 及PODXL 表達量比較與正常皮膚組織比較，瘢痕疙瘩組織中SNHG14 與PODXL 的表達量升高（P＜0.05），miR?148a?3p 的表達量降低（P＜0.05）；Pearson 法檢測瘢痕疙瘩組織中SN?HG14 與miR?148a?3p 的相關性，以及miR?148a?3p與PODXL 的相關性，結果顯示，SNHG14 與miR?148a?3p呈負相關（r=-0.803 1，P＜0.001），miR?148a?3p 與PODXL 呈負相關（r=-0.855 9，P＜0.001），SNHG14與PODXL呈正相關（r=0.724 1，P＜0.001），見圖1-2 及表1。

圖1 Western blot 法檢測PODXL 表達量Fig.1 Western blot was used to detect the expression of PODXL

圖2 瘢痕疙瘩組織中SNHG14、miR?148a?3p 及PODXL 表達量之間的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between SNHG14,miR?148a?3p and PODXL expression in keloid tissue

表1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中SNHG14、miR?148a?3p 比較Tab.1 Comparison of SNHG14 and miR?148a?3p in keloid tissue and normal skin tissue ±s

表1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中SNHG14、miR?148a?3p 比較Tab.1 Comparison of SNHG14 and miR?148a?3p in keloid tissue and normal skin tissue ±s

注：與正常皮膚組織比較，*P ＜0.05

組別正常皮膚組織瘢痕疙瘩組織t 值P 值SNHG14 1.00±0.07 2.51±0.56*17.340＜0.001 miR?148a?3p 1.00±0.09 0.37±0.10*30.348＜0.001

2.2 干擾SNHG14 表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、克隆的影響與si?NC 組比較，si?SNHG14 組SNHG14 與PODXL 的表達量降低（P＜0.05），miR?148a?3p 的表達水平升高（P＜0.05），細胞活力降低（P＜0.05），克隆形成數減少（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 干擾SNHG14 表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、克隆的影響Tab.2 The effect of interference with SNHG14 expression on the proliferation，cloning of keloid fibroblasts±s

表2 干擾SNHG14 表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、克隆的影響Tab.2 The effect of interference with SNHG14 expression on the proliferation，cloning of keloid fibroblasts±s

注：與si?NC 組比較，*P ＜0.05

組別si?NC si?SNHG14 t值P值SNHG14 1.00±0.05 0.26±0.05*31.396＜0.001 miR?148a?3p 1.00±0.07 2.94±0.43*13.359＜0.001 OD值0.82±0.03 0.30±0.04*31.200＜0.001克隆形成數（個）121.44±11.27 52.33±7.38*15.390＜0.001

圖3 Western blot 法檢測PODXL 表達量Fig.3 Western blot was used to detect the expression ofPODXL

2.3 干擾SNHG14 表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移、侵襲及膠原合成相關蛋白表達量的影響與si?NC 組比較，si?SNHG14 組遷移與侵襲細胞數均明顯減少（P＜0.05），ProcollagenⅠ、α?SMA、Col1 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖4、表3。

圖4 Western blot 法檢測Procollagen Ⅰ、α?SMA、Col1 表達量Fig.4 Western blot method was used to detect the expression of Procollagen Ⅰ，α?SMA，and Col1

表3 干擾SNHG14 表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移、侵襲的影響Tab.3 The effect of interference with SNHG14 expression on the migration and invasion of keloid fibroblasts±s

表3 干擾SNHG14 表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移、侵襲的影響Tab.3 The effect of interference with SNHG14 expression on the migration and invasion of keloid fibroblasts±s

注：與si?NC 組比較，*P ＜0.05

組別si?NC si?SNHG14 t 值P 值遷移細胞數（個）116.22±10.47 43.11±5.88*18.265＜0.001侵襲細胞數（個）122.22±12.98 49.67±10.93*12.826＜0.001

2.4 SNHG14 靶向調控miR?148a?3p，以及miR?148a?3p 靶向調控PODXLSNHG14 與miR?148a?3p 存在結合位點，miR?148a?3p 與PODXL 存在結合位點，見圖5A、B。轉染miR?148a?3p mimics 可降低含有WT?SNHG14 或WT?PODXL 的瘢痕疙瘩成纖維細胞的熒光素酶活性（P＜0.05），而未能抑制含有MUT?SNHG14 或MUT?PODXL 的瘢痕疙瘩成纖維細胞的熒光素酶活性，見圖5C。

圖5 SNHG14 靶向調控miR?148a?3p，以及miR?148a?3p 靶向調控PODXLFig.5 SNHG14 targeted miR?148a?3p and miR?148a?3p targets PODXL

3 討論

SNHG14 可通過調節miR?206/YWHAZ 分子軸促進宮頸癌的進展［14］。SNHG14 通過充當miR?613的競爭性內源RNA，調節膜聯蛋白A2 的表達而促進胰腺癌細胞增殖及轉移［15］。SNHG14 通過充當miR?655?3p 的競爭性內源RNA 促進子宮內膜癌細胞增殖［16］。本研究結果顯示，瘢痕疙瘩組織SNHG14 的表達量升高，干擾SNHG14 表達后可明顯降低瘢痕疙瘩成纖維細胞活力，還可促使克隆形成數減少，提示干擾SNHG14 表達可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及克隆形成。瘢痕疙瘩類似于腫瘤生物學特性，膠原蛋白生成量增多可造成局部皮膚纖維組織過度增生而促使病理性瘢痕的形成，Procollagen Ⅰ、α?SMA、Col1 在瘢痕疙瘩中表達量升高，抑制其表達可能抑制膠原蛋白合成，減少細胞外基質沉積［17-18］。本研究結果顯示，干擾SNHG14 表達后瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移與侵襲細胞數均明顯減少，Procollagen Ⅰ、α?SMA、Col1 蛋白水平降低，提示干擾SNHG14 表達可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移、侵襲及膠原蛋白合成，進而減少細胞外基質沉積。

為進一步探究SNHG14 在瘢痕疙瘩形成過程中的分子機制，本研究證實SNHG14 可靶向結合miR?148a?3p，瘢痕疙瘩組織中miR?148a?3p 的表達量降低，且SNHG14 與miR?148a?3p 呈負相關，而干擾SNHG14 表達后miR?148a?3p 的表達水平升高，提示干擾SNHG14 表達可能通過靶向調控miR?148a?3p而參與瘢痕疙瘩形成過程。研究表明miR?148a?3p 主要通過靶向c?Met 抑制上皮性卵巢癌的進展［19］。miR?148a?3p通過調控ERBB3/AKT2/c?myc和DNMT1 而抑制膀胱癌細胞增殖［20］。LncRNA SNHG4 通過靶向miR?148a?3p 調節c?Met 促進宮頸癌的進展［21］。進一步研究發現瘢痕疙瘩組織中miR?148a?3p與PODXL呈負相關，SNHG14與PODXL呈正相關，瘢痕疙瘩組織中PODXL 的表達量升高，干擾SNHG14 表達后PODXL 的表達量降低。研究表明NNT?AS1 通過靶向miR?1301?3p/PODXL軸并激活Wnt 途徑而促進膀胱癌細胞的生長［22］。LncRNA BBOX1?AS1 通過靶向miR?361?3p 而增強PODXL 表達從而促進卵巢癌的發展［23］。本研究結果提示SNHG14 可能通過調控miR?148a?3p/PODXL軸而促進瘢痕疙瘩形成。

綜上所述，瘢痕疙瘩組織SNHG14 與PODXL的表達量升高，而miR?148a?3p 的表達量降低，干擾SNHG14 表達可通過促進miR?148a?3p 表達而抑制PODXL 表達從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、克隆形成、遷移、侵襲及膠原蛋白合成。下一步將進行體內動物實驗證實SNHG14/miR?148a?3p/PODXL 軸在瘢痕疙瘩生長進程中的作用機制。