穿心蓮內酯對人乳腺癌細胞遷移和侵襲的抑制作用

傅鶴秀,鹿蓓蓓,陳秋云,高靜

(江蘇大學 1.藥學院,2.化學化工學院,江蘇 鎮江 212013)

三陰性乳腺癌是一類雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體表達均為陰性的特殊乳腺癌類型[1],由于腫瘤異質性高且缺乏有效治療靶點,極易發生遷移復發,是預后最差、致死率最高的一種乳腺癌類型[2-3]。在正常細胞中,葡萄糖轉化生成的丙酮酸進入線粒體,通過丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)氧化脫羧生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環,為細胞提供能量,而在腫瘤細胞中,葡萄糖轉化生成的丙酮酸大部分會生成乳酸維持腫瘤細胞內環境的穩態[4]。尤其在具有遷移性的癌細胞中,糖酵解產生的大量乳酸最終排出胞外,堆積形成腫瘤生長局部的酸性環境,利于其自身對周圍組織的侵襲和浸潤性生長[5]。近年研究發現,位于線粒體內膜上的解偶聯蛋白-2(uncoupling protein-2,UCP2)在腫瘤的代謝中發揮重要作用。有研究表明,通過轉染構建穩定高表達UCP2的結腸癌HCT116細胞,與空白轉染組相比,轉染組細胞產生了更多的乳酸[6]；此外,當UCP2被激活時,可以產生質子滲漏,降低線粒體在呼吸時形成的H+梯度,使氧化磷酸化解偶聯,ATP合成降低,導致細胞代謝中的能量以鈉泵的途徑消耗和以熱能的形式釋放出來[7],可見UCP2在癌細胞中起到調節能量代謝的作用。

穿心蓮內酯(Andrographolide)是一種從藥用植物穿心蓮(Andrographispaniculata)中分離出的二萜內酯,具有抗炎[8-9]、肝保護[10]和抗感染[11]作用。近年來,穿心蓮內酯的抗癌作用引起研究者的廣泛關注[12-13],在抑制腫瘤遷移與侵襲方面,穿心蓮內酯能夠通過促細胞凋亡抑制腎細胞癌786-0細胞的遷移能力[14]；對于胃癌細胞來說,穿心蓮內酯可能通過增加基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑的表達并降低MMPs的表達和活性來抑制其增殖和遷移[15]；在以往研究中,穿心蓮內酯主要通過抑制MMPs來抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移與侵襲[16]。本文旨在研究穿心蓮內酯是否可以通過調節UCP2抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移與侵襲能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

穿心蓮內酯(江西青峰藥業)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物)；二甲亞砜(DMSO,國藥集團化學試劑有限公司)；青霉素、鏈霉素(新賽美生物科技有限公司)；Matrigel膠(美國Corning公司)；TBST(北京索萊寶科技有限公司)；甲基噻唑基四唑(MTT,美國Amresco公司)；JC-1探針(德國Sigma-Aldrich 公司)；Trizol試劑(美國Ambion公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix(日本TaKaRa公司)；SYBR Green染料(北京天根生化科技有限公司)；BeyoClickTMEdU-488試劑盒(上海碧云天生物公司)；乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；β-肌動蛋白小鼠單克隆抗體、UCP2兔單克隆抗體(上海碧云天生物公司)；PDH兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗(武漢三鷹生物公司)；乳腺癌MDA-MB-231細胞購于上海中喬新舟公司。

1.2 儀器

細胞培養箱(上海賽默飛公司)；SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺(上海蘇凈實業有限公司)；Mini-PROTEIN 3電泳系統、Bio-RAD 525電泳儀(美國Bio-RAD公司)；TS100 Nikon 倒置相差顯微鏡、Ti-E顯微鏡活細胞工作站(日本Nikon公司)；Spectra MaxGemini酶標儀(美國Molecular Device公司)；Sigma 1-13高速臺式離心機(德國Sigma公司)。

1.3 藥物處理

稱取適量穿心蓮內酯,用DMSO稀釋成100 mmol/L的母液,保存于4 ℃冰箱,母液僅可使用1周。進行實驗時,將母液用培養基稀釋1 000倍后配成需要的藥物濃度進行細胞處理。

1.4 MTT法檢測MDA-MB-231細胞活力

將MDA-MB-231細胞(5×104/mL)接種于96孔板中,每孔100 μL細胞懸液,待貼壁后給藥組分別加入不同濃度穿心蓮內酯(0,5,10,20,40和80 μmol/L),對照組僅更換培養基,繼續培養24 h,每孔加入100 μL的 MTT溶液(1 g/L)繼續培養4 h,棄上清液,每孔再加入100 μL的DMSO,放置搖床直至藍紫色結晶消失,并使用酶標儀在562 nm處測量光密度(D)值,計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(D給藥組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%

1.5 BeyoClickTM EdU-488試劑盒檢測細胞增殖能力

將處于對數生長的細胞(5×104/mL)接種于24孔板中,每孔500 μL,培養24 h,待貼壁后分別加入不同濃度穿心蓮內酯(0,5,10,20,40和80 μmol/L),繼續培養24 h,給藥結束后用移液槍將24孔板中原有培養基吸掉375 μL后加入 125 μL EdU工作液,37 ℃、5% CO2培養箱孵育2 h后,去掉板內的培養基,加入1 mL 4%的多聚甲醛室溫固定15 min。每孔加入1 mL洗滌液洗滌細胞3次,每次3～5 min,再加入1 mL通透液,室溫孵育15 min。再次洗滌細胞后每孔加入100 μL的Click反應液室溫避光孵育30 min。用移液槍吸除Click反應液,洗滌細胞后每孔加1×Hoechst 33342溶液250 μL,室溫避光孵育10 min。再次洗滌后每孔加入500 μL PBS,將24孔板置于倒置熒光顯微鏡下拍照,以熒光強度反映細胞增殖情況。

1.6 傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力

將處于對數生長的細胞(5×104/mL)接種于6孔板中,待其鋪滿皿底后用10 μL移液管尖端制成恒定寬度的劃痕,用PBS洗滌細胞2次以除去懸浮的細胞,不同濃度穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)作用于細胞,分別在給藥后0,12,24 h于倒置顯微鏡下拍照,計算不同時間的劃痕寬度。Δ劃痕寬度(μm)=0 h劃痕寬度(μm)-12 h或24 h劃痕寬度(μm)。

1.7 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力

取不同濃度穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)處理24 h后的細胞,用無血清DMEM培養基稀釋的細胞混懸液作為上室,每小室加200 μL,預先用Matrigel凝膠覆蓋板底的24孔板作為下室,每孔加500 μL含10% FBS DMEM培養基,37 ℃孵育24 h后取出 Transwell 小室,棄去孔中培養液,PBS洗2遍,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,再用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色1 h,PBS清洗至溶液澄清,高倍顯微鏡下每個濃度選擇5個視野計數并取平均值,計算經不同濃度穿心蓮內酯作用后,侵入到下室的細胞數。

1.8 蛋白質印跡檢測細胞UCP2和PDH蛋白水平

用不同濃度的穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)處理后提取細胞總蛋白,進行蛋白定量后,加入5×SDS凝膠上樣緩沖液,煮沸5 min。將等量的蛋白質進行15% SDS-PAGE,并將分離的蛋白質遷移到PVDF膜上。使用脫脂奶粉(5%)將膜封閉1 h,并將UCP2及PDH抗體以1∶ 1 000稀釋度4 ℃過夜,TBST洗3次,二抗室溫孵育1 h,TBST 清洗3次,ECL發光液發光,Minichemi 發光成像儀曝光,并使用Quantity One軟件分析蛋白相對灰度值。

1.9 RT-PCR檢測細胞UCP2 mRNA表達

使用Trizol試劑提取總RNA,用PrimeScriptTMRT Master Mix進行逆轉錄。按照說明書操作,使用SYBR Green染料進行RT-PCR。引物序列如下,GAPDH上游:5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′,下游:5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；UCP2上游:5′-GTGGTCAAGACGAGATACATGA-3′,下游5′-CTGCT-CATAGGTGACGAACATC-3′。熱循環反應:95 ℃持續10 min,95 ℃循環40次,每次15 s,60 ℃延伸1 min。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

1.10 乳酸試劑盒檢測細胞內乳酸含量

將MDA-MB-231細胞在培養皿中培養,穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)處理24 h后,按照乳酸試劑盒說明書操作,將樣品充分混勻,37 ℃反應30 min,置于1 cm玻璃比色皿中,空白管調零,用可見分光光度計測定530 nm處D值,繪制標準曲線,并計算樣品細胞內乳酸含量。乳酸含量(mmol/L)=(樣品D值-空白D值)/(標準D值-空白D值)×標準品濃度(mmol/L)×樣品測試前稀釋倍數。

1.11 JC-1探針染色檢測線粒體膜電位

將MDA-MB-231細胞接種于96孔板中,用不同濃度穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)處理24 h后,每孔加入100 μL 稀釋后的JC-1探針(5 g/L),37 ℃、5% CO2避光孵育30 min,通過熒光酶標儀檢測細胞熒光強度(激發波長488 nm/發射波長535 nm用于JC-1綠色,激發波長488 nm/發射波長595 nm用于JC-1紅色),用紅、綠熒光比值反映線粒體膜電位。

1.12 統計學方法

2 結果

2.1 穿心蓮內酯對MDA-MB-231乳腺癌細胞存活率的影響

與0 μmol/L組相比,5 μmol/L穿心蓮內酯的細胞存活率為79.99%(t=10.42,P<0.05)。隨著濃度的升高,細胞存活率逐漸降低；當穿心蓮內酯濃度為10,20,40,80 μmol/L時,細胞存活率分別為64.73%,43.55%,26.27%,24.83%,差異有統計學意義(t=18.91,t=57.75,t=64.02,t=80.08,P均<0.01),通過軟件計算可得IC50為22.36 μmol/L。見圖1。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L穿心蓮內酯組比較圖1 穿心蓮內酯對MDA-MB-231細胞存活率的影響

2.2 穿心蓮內酯對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的影響

除80 μmol/L穿心蓮內酯對細胞有明顯的抑制作用外(t=7.257,P<0.05),5,10,20,40 μmol/L組對細胞均無顯著的抑制作用。結合MTT結果,其IC50為22.36 μmol/L,即選擇10,20,40 μmol/L穿心蓮內酯進行后續實驗。見圖2。

Hoechst染細胞核,EdU染細胞內的DNAa:P<0.05,與0 μmol/L穿心蓮內酯組比較圖2 穿心蓮內酯對MDA-MB-231細胞增殖的影響(×20)

2.3 穿心蓮內酯對MDA-MB-231乳腺癌細胞遷移與侵襲能力的影響

在單層培養細胞間制作劃痕以產生愈傷區域,然后觀察該傷口周圍細胞向劃痕遷移的現象,即傷口愈合。細胞遷移能力越弱,意味著傷口愈合速度減慢,也就是劃痕寬度減少。傷口愈合實驗結果顯示,隨著藥物濃度的增加或處理時間延長,其細胞的傷口愈合速度逐漸減慢；給予不同濃度的穿心蓮內酯后,Transwell小室結果顯示,MDA-MB-231細胞侵襲到下室的數量隨著藥物濃度的增加逐漸減少(t=5.237,P<0.05；t=12.66,P<0.01；t=18.08,P<0.01)。見圖3。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L穿心蓮內酯組比較；標尺=100 μm圖3 穿心蓮內酯對MDA-MB-231細胞遷移與侵襲能力的影響

2.4 穿心蓮內酯對UCP2 mRNA以及蛋白表達的影響

從蛋白質數據庫查到人UCP2的編碼為PDB:2LCK,使用AutoDock 4.2程序進行分子對接,通過計算機分子模擬顯示,穿心蓮內酯與UCP2有一定的結合力,且與UCP2的Gly151結合力較強。隨后收集穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)處理的蛋白和RNA檢測UCP2的表達水平。RT-PCR結果顯示,隨著藥物濃度的升高,UCP2mRNA表達下調(t=7.267,P<0.05；t=24.23,P<0.01；t=15.53,P<0.01)。蛋白質印跡結果顯示,不同濃度的穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)處理細胞24 h后,實驗組中UCP2的蛋白表達下調(t=9.435,P<0.05；t=14.76,P<0.01；t=19.73,P<0.01)。見圖4。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L穿心蓮內酯組比較圖4 穿心蓮內酯對UCP2 mRNA以及蛋白表達的影響

2.5 穿心蓮內酯對MDA-MB-231乳腺癌細胞能量代謝的影響

給予穿心蓮內酯(0,10,20,40 μmol/L)后,與0 μmol/L組相比,細胞內乳酸水平降低(t=7.559,P<0.05；t=10.04,P<0.05；t=19.4,P<0.01)；細胞的紅綠熒光比呈顯著性升高(t=11.74,P<0.05；t=8.416,P<0.05；t=30.51,P<0.01)。此外,蛋白質印跡結果顯示,實驗組中PDH蛋白表達上調(t=8.012,t=11.07,t=11.69,P均<0.05),提示MDA-MB-231細胞的氧化磷酸化水平升高。見圖5。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L 穿心蓮內酯組比較圖5 穿心蓮內酯對MDA-MB-231細胞能量代謝的影響

3 討論

惡性腫瘤細胞代謝的重要特征之一就是以糖酵解作為主要的能量獲取方式,主要表現為細胞內的葡萄糖轉化生成的丙酮酸通過乳酸脫氫酶轉變成乳酸,供自身合成時的能量需要,這種代謝方式稱為Warburg效應[17]。三陰性乳腺癌可以利用糖酵解產生的大量乳酸促進遷移與侵襲能力,使其死亡率較其他類型乳腺癌高。因此,探究通過調節三陰性乳腺癌代謝方式來抑制其遷移與侵襲能力成為研究的重點方向。

本研究首先通過MTT法檢測發現,穿心蓮內酯在較低濃度下能夠抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的活力,通過EdU試劑盒檢測可以看出高濃度的穿心蓮內酯(40 μmol/L)不會抑制細胞的增殖作用,并且傷口愈合以及Transwell小室實驗初步證明了穿心蓮內酯可以抑制MDA-MB-231細胞的遷移與侵襲能力。

Pelicano等[18]研究表明,與非三陰性乳腺癌細胞相比,三陰性乳腺癌細胞的耗氧量顯著降低,而葡萄糖的攝取和乳酸的產生則顯著增加,說明糖酵解在三陰性乳腺癌中發揮重要作用。本研究結果表明,穿心蓮內酯能夠下調三陰性乳腺癌細胞內乳酸含量,并且用穿心蓮內酯處理后的細胞線粒體膜電位升高,PDH的蛋白表達升高,PDH表達的上調預示著有較多的丙酮酸進入線粒體進行氧化磷酸化,穿心蓮內酯改善了乳腺癌細胞的代謝方式。因此推測穿心蓮內酯抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移與侵襲能力可能是通過下調糖酵解實現的。

UCP2作為線粒體內膜上的解偶聯蛋白,在許多人類癌癥中高表達,包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和皮膚癌[19]。Ohkouchi等[20]研究表明,UCP2在腫瘤中的高表達能夠提高腫瘤利用糖酵解水平,促進其生成更多的乳酸。而利用葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖作用于UCP2過表達的HCT116細胞,則明顯抑制了腫瘤細胞糖酵解進程,從而抑制腫瘤細胞生長[21]。由此可見,UCP2參與腫瘤細胞的能量代謝與糖酵解密切相關。

為進一步探究這種下調糖酵解作用是否與UCP2相關,本研究采用分子對接軟件分析,發現穿心蓮內酯能與UCP2的多個蛋白位點結合,其中與Gly151結合力最強。RT-PCR以及蛋白質印跡結果表明,穿心蓮內酯處理后的細胞UCP2mRNA和蛋白表達下調。因此推測穿心蓮內酯下調糖酵解的作用可能與UCP2有關。

綜上所述,穿心蓮內酯可能通過抑制三陰性乳腺癌的糖酵解和改變能量代謝的方式抑制MDA-MB-231細胞的遷移與侵襲,其機制可能與UCP2有關。