硫酸銅和馬度米星銨聯合暴露對鯽魚的毒性和效應標記物研究

高修歌，楊丹，宋昕昊，彭麟，季輝，郭大偉，江善祥

南京農業大學動物醫學院，南京 210095

目前環境中抗生素與重金屬的復合污染現象日益嚴重，復合污染產生的環境效應與單一污染不同[1]，對生態環境和人體健康構成潛在威脅[2]。銅是水體污染中最常見的重金屬之一[3]，也是生命體必需的微量元素。水中的銅污染源有許多，如漁業生產中使用的CuSO4、從空氣中沉降進入水體的懸浮物、農業灌溉和工業生產排放的含銅廢液等。當水中Cu2+濃度超出限度，會對水生動物造成嚴重危害甚至導致死亡[4]。在生產實踐中，由于未合理使用銅制劑導致水生動物銅中毒的事件屢有發生。姚志峰等[5]研究發現，中華鱘體內抗氧化酶的活性隨著Cu2+濃度的升高而降低，體內氧化物質不斷積累，對細胞膜結構造成損傷，從而導致死亡。有學者指出，貝類可通過進食等多種途徑吸收水環境中的碘化銅，對Cu2+有較強的富集能力[6]。當Cu2+在體內蓄積到一定量時，可通過食物鏈進入人體，對人類健康構成潛在威脅[7]。研究發現，Cu2+對斑馬魚胚胎96 h的半數致死濃度(50% lethal concentration, LC50)是2.5 μg·L-1，Cu2+可誘導斑馬魚心臟細胞凋亡[8]，且抑制胚胎的生長發育和孵化[9]。魚鰓是吸收Cu2+的主要部位，進入機體的Cu2+首先在腸道富集，隨后通過生化反應和血液運輸至機體其他部位[10]，最終主要在肝臟中富集，造成肝組織損傷[11]。因此，Cu2+的生態毒性效應仍是亟待解決的重要環境問題之一。

馬度米星銨(maduramicin)是一種聚醚類離子載體抗生素，廣泛用于肉雞球蟲病的防治[12]。其在雞體內代謝較快且大部分以藥物原型通過雞糞進入土壤中，進一步污染水體等環境[13]。美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)新獸藥申報材料顯示，馬度米星銨經水體染毒引起虹鱒魚死亡的96 h-LC50為5.0 mg·L-1，引起藍鰓太陽魚死亡的96 h-LC50為1.4 mg·L-1，對藍鰓太陽魚的毒性為高毒，馬度米星銨對大型溞48 h半數有效濃度(median effective concentration, EC50)為7.5 mg·L-1。馬度米星銨對克氏原螯蝦的96 h-LC50為67.03 mg·L-1[14]，說明克氏原螯蝦對馬度米星銨的耐受力較高[15]。馬度米星銨對斑馬魚的96 h-LC50為13.33 mg·L-1[16]。然而馬度米星銨對不同水生生物的毒性效應仍不可知，有待進一步探究。

鯽魚是我國最常見的淡水魚類之一，在我國廣泛養殖。鯽魚作為實驗用動物，可應用于毒理學、比較病理學及環境科學等科研領域。鯽魚對農藥、重金屬等化學品較為敏感，是研究水生態毒理學的理想模型之一[17-18]。王曉峰等[19]通過檢測鯽魚體內多氯聯苯的含量，評價電子垃圾拆解地區的環境污染狀況。王宗保等[20]成功建立鯽魚肝臟腫瘤模型，為腫瘤學研究提供了新的可能。鯽魚在藥物安全性及療效評價方面也占有重要地位，已有學者研究了四環素、奧比沙星及甲苯達唑等藥物在鯽魚體內的藥物動力學、毒性及殘留[21-23]，為藥物合理使用提供了科學依據。

目前，環境中抗生素與重金屬的復合污染現象日益嚴重，抗生素與重金屬結合后可能扮演一種未知的環境角色，產生的環境效應與單一污染的作用不同，對生態環境和人類健康構成潛在威脅[24]。馬度米星銨和Cu2+在水環境中可能共存，對水生物造成潛在危害。為明確Cu2+和馬度米星銨復合污染對水生生物的毒性效應，本研究擬以鯽魚為試驗動物，從不同角度探討硫酸銅和馬度米星銨對鯽魚的單一及聯合毒性作用，以期為重金屬和抗生素的合理使用及水生態環境保護提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

增氧氣泵(S-50BX型，塞爾科技，中國)，溶解氧測定儀(AR8010型，?，攦x表集團有限公司，中國)，水質硬度檢測儀(TDS型，力晨科技，中國)，pH計(SX-610型，上海三信儀表廠，中國)，體視顯微鏡(SZ51型，奧林巴斯公司，日本)，微型電動勻漿器(1658050型，伯樂公司，美國)，切片機(RM型，上海徠卡儀器，中國)，微量紫外分光光度計(NanoDrop 2000型，賽默飛世爾公司，美國)，PCR儀(T100型，伯樂公司，美國)，熒光定量PCR儀(CFX96型，伯樂公司，美國)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司，中國)，熒光顯微鏡(DP73型，奧林巴斯公司，日本)。

馬度米星銨(含量91.9%，浙江匯能生物股份有限公司)，CuSO4·5H2O(純度99.0%，國藥集團化學試劑有限公司)，異丙醇(純度99.5%，上海申博化工有限公司)，DNase/RNase-Free Water、Tris-HCl、吉姆薩濃縮染液、乙二胺四乙酸二鈉、胰蛋白酶消化液購自北京索萊寶科技有限公司，三氯甲烷、丙酮、鹽酸和氫氧化鈉購自上海凌峰化學試劑公司，均為分析純，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(RR420A)、RNAiso Plus(9108)和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)(RR047A)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，總蛋白定量測定試劑盒(A045-4-2)、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001-3-2)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(A007-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(A005-1-2)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003-1-2)、脫氧核糖核酸(DNA)損傷試劑盒(G010-1-1)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗用動物

體質量(146±15) g的鯽魚購于南京特給力種植專業合作社，置于帆布魚池中(1 m×1 m×0.8 m)。實驗用水為充分曝氣除氯的自來水(pH值約為7，溫度(20±2) ℃，溶氧量始終>6 mg·L-1，總硬度為80 mg·L-1)。鯽魚在上述水環境中適應性馴養一周，保證12 h∶12 h的光照/黑暗周期，增氧泵24 h持續泵氧。馴養期間每天換水1次，定時按體質量1%投喂不含抗生素的全價魚飼料并清理池底糞便及剩余飼料，一周內自然死亡率低于5%才可用于后續試驗。

1.3 方法

1.3.1 硫酸銅對鯽魚的急性毒性

急性毒性實驗采用半靜態染毒法[25]，依據預試驗得到的100%致死濃度和最大耐受濃度，等比設計7個濃度組(2.5、3.4、4.6、6.2、8.4、11.4和15.5 mg·L-1CuSO4)和空白對照組，每組設置3個平行，每個平行10尾鯽魚。鯽魚在試驗前一天禁食直至試驗結束，試驗期間，每隔24 h更換一半染毒溶液并補充至初始濃度，在試驗開始的第2～8小時內觀察鯽魚的臨床表現，每隔24 h記錄鯽魚的中毒表現及死亡尾數，連續觀察96 h。試驗過程中及時清出死魚，判斷標準為鰓蓋停止活動，用玻璃棒輕觸魚尾部，5 min內魚無反應。采用寇氏法計算硫酸銅對鯽魚的96 h-LC50和安全濃度。

1.3.2 硫酸銅和馬度米星銨聯合暴露對鯽魚的急性毒性

本實驗室前期研究表明馬度米星銨對鯽魚的96 h-LC50為11.22 mg·L-1(數據尚未發表)，以硫酸銅和馬度米星銨對鯽魚96 h-LC50值為一個毒性單位，按毒性1∶1的混合比例[8]，設置0.1、0.2、0.4、0.8和1.6毒性單位混合染毒液進行聯合毒性試驗，并設對照組，每組設3個平行，每個平行10尾鯽魚，試驗方法與單一染毒試驗相同。采用Marking相加指數法[9]評價其聯合毒性大小，公式如下：

式中：S表示混合物毒性之和；A和B分別為單一染毒的LC50；Am和Bm分別為聯合染毒的LC50。運用S值計算相加指數(additive index, AI)值，用AI判斷聯合毒性，當S≤1時，AI=1/S-1；當S>1時，AI=-S+1。AI>0時為協同作用，AI=0時為加和作用，AI<0時為拮抗作用。

1.3.3 硫酸銅和馬度米星銨聯合暴露對鯽魚的亞急性毒性

根據急性毒性試驗結果，依據《漁業水質標準》(GB 11607—89)對養殖水體中銅離子的濃度要求及亞急性毒性試驗設計基本原則，分別以硫酸銅和馬度米星銨聯合染毒時96 h-LC50的1/140和1/10作為低、高2個劑量組，并按毒性1∶1進行聯合染毒，具體分組如表1所示。每組設3個平行，每個平行24條鯽魚，持續染毒21 d。

1.3.4 樣品采集

在持續染毒第7天和第21天，分別從各組隨機取6尾鯽魚，頭部穿刺處死，解剖取肝臟，放入凍存管中，液氮速凍后轉存于-80 ℃。染毒第21天，分別從各組隨機取6尾鯽魚，斷尾采血。在4 ℃條件下，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，用于血生化分析。染毒第21天，分別從各組隨機取6尾鯽魚，斷尾采血，用于制備血涂片，同時，解剖取肝臟，用于制備肝細胞懸液。

1.3.5 血生化的測定

采用全自動生化分析儀檢測鯽魚血清中的堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性。

1.3.6 抗氧化酶活性的測定

從-80 ℃取出樣品，冰上解凍，按1∶9的質量體積比加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰上勻漿，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液檢測相關生化指標。總蛋白濃度、SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的酶活性及MDA含量的測定步驟參照試劑盒說明書。

1.3.7 抗氧化酶相關基因的表達分析

采用實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)測定基因sod、cat和gpx的mRNA表達，應用Primer Premier 5.0設計基因引物(表2)，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。將待測鯽魚肝臟組織從-80 ℃冰箱中取出后在液氮中研磨后，快速轉移至2 mL管中，加入1 mL RNAiso，冰上勻漿。加入0.2 mL氯仿，渦旋后12 000 r·min-1離心15 min，轉移上清。加入1 mL異丙醇，渦旋后12 000 r·min-1離心10 min，棄液。加入75%乙醇(1 mL)洗滌，12 000 r·min-1離心5 min，棄液，洗滌2次。室溫干燥8～10 min，加DEPC水80 μL溶解，RNA溶液于-80 ℃短期保存。測定RNA樣品中RNA濃度及OD值，以OD260/OD280比值判斷RNA純度，比值為1.8～2.0的RNA作反轉錄。反轉錄過程及RT-qPCR程序參見本實驗室已發表文獻[16]，以ef1α為內參基因，按照2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.3.8 外周血微核試驗

鯽魚斷尾取血，前2～3滴丟棄，用預先經肝素鈉溶液濕潤過的槍頭吸取尾部的外周血，滴加到潔凈載玻片的一端，取另一蓋玻片以30°左右的夾角均勻推動血液，在玻片上形成一層血膜，晾干后甲醇中固定15 min。血涂片置于染缸中，10%吉姆薩染液室溫下染色15 min。蒸餾水從一端沖洗，自然晾干。使用顯微鏡的油鏡觀察染色后的血膜并用MShot Image Analysis System軟件拍照。每張血涂片觀察并拍照1 000個細胞，計算微核率，公式如下：

微核率(‰)=觀察到含微核細胞數/觀察細胞總數×1000‰

表1 染毒劑量與分組Table 1 Exposure doses and group setting

1.3.9 單細胞凝膠電泳1.3.9.1 試劑溶液配制

稱取0.20 g 0.5%正常熔點瓊脂糖，加PBS 40 mL，加熱溶解；稱取0.14 g 0.7%低熔點瓊脂糖，加PBS 20 mL，加熱溶解。0.4 mg·L-1Tris-HCl：稱取Tris 12.114 g，加水溶解，HCl調pH值至7.5，定容至250 mL。300 mmol·L-1NaOH：稱取NaOH 3.0 g，加水溶解，定容至250 mL。1 mmol·L-1EDTA-Na2：稱取EDTA-Na20.1861 g，加水溶解，定容至500 mL。堿性電泳緩沖液：將EDTA-Na2與NaOH溶液等體積混合，調節pH值>13，現用現配。

1.3.9.2 肝細胞懸液制備

鯽魚解剖取肝臟于離心管中，加入所取組織10倍體積的0.25%胰蛋白酶，4 ℃消化15 min，1 000 r·min-1離心5 r·min-1，棄上清，PBS清洗，過200目細胞篩，細胞計數，調整細胞濃度至1×106個·mL-1左右。

1.3.9.3 單細胞凝膠電泳步驟

制備瓊脂糖膠。第1層：載玻片上滴加正常熔點瓊脂糖100 μL，加蓋玻片，4 ℃固化。第2層：取肝細胞懸液10 μL與低熔點瓊脂糖75 μL混勻，滴加至第1層，加蓋玻片，4 ℃固化。第3層：揭去蓋玻片，滴加低熔點瓊脂糖75 μL，加蓋玻片，4 ℃固化。

細胞裂解：玻片浸入冷的細胞裂解液中，4 ℃避光1.5 h。DNA堿解旋：向電泳槽中加入電泳緩沖液，載玻片浸于液面以下，堿解旋30 min。電泳：電壓25 V，電流300 mA，電泳30 min。中和：載玻片置于平皿中，加Tris-HCl，4 ℃中和10 min，中和3次，棄去Tris-HCl。染色鏡檢：加PI染液20 μL，加蓋玻片，避光染色10 min，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.10 數據處理及分析

用Excel分析數據，按寇式法計算LC50和安全濃度，公式如下：

95%可信限=lg-1(lgLC50±1.96×Sm)

式中：Xi是劑量對數，Pi是死亡率，Sm是標準誤，d是對數差，n是實驗動物數。采用SPSS 26.0軟件統計分析，差異顯著性檢驗采用單因素方差分析(One-way ANOVA, LSD)。結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示，并用GraphPad Prism 8軟件作圖。用CASP 1.22軟件分析彗星圖像。

2 結果(Results)

2.1 硫酸銅和馬度米星銨單一或聯合暴露對鯽魚的急性毒性

由表3可知，硫酸銅對鯽魚的96 h-LC50為3.6 mg·L-1，其95%置信區間是3.31～3.95 mg·L-1，安全濃度為0.36 mg·L-1。硫酸銅和馬度米星銨聯合暴露時，硫酸銅對鯽魚的96 h-LC50為1.4 mg·L-1，其95%置信區間是1.16～1.73 mg·L-1，安全濃度為0.14 mg·L-1；馬度米星銨對鯽魚的96 h-LC50為4.2 mg·L-1，其95%置信區間是3.45～5.16 mg·L-1，安全濃度為0.42 mg·L-1。采用水生毒理聯合效應Marking相加指數法[9]評價硫酸銅和馬度米星銨的聯合毒性大小，生物毒性之和為0.76，AI值為0.31，AI>0，表明硫酸銅與馬度米星銨對鯽魚的聯合急性毒性為協同作用。

表2 RT-qPCR的引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

2.2 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚肝臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響

2.2.1 硫酸銅單一暴露對鯽魚肝臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

如圖1(a)所示，與空白對照組相比，Cu1組鯽魚肝臟中SOD活性無顯著變化(P>0.05)；染毒第21天，Cu2組SOD活性顯著低于對照組(P<0.05)。染毒期間，Cu2組CAT活性均低于對照組；染毒第7天，Cu2組CAT活性顯著低于對照組(P<0.05)，如圖1(b)所示。染毒第21天，Cu2組GPx活性顯著低于對照組(P<0.05)，如圖1(c)所示。Cu1和Cu2組MDA含量在染毒期間逐漸升高，存在時間-效應關系(圖1(d))，但與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 馬度米星銨單一暴露對鯽魚肝臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

與空白對照組相比，染毒第21天，MAD1組SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，如圖2(a)所示。染毒第7天，MAD1組CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)，如圖2(b)所示。染毒第21天，MAD2組GPx活性顯著低于對照組(P<0.05)，如圖2(c)所示。染毒第21天，MAD2組MDA含量顯著高于對照組(P<0.01)，如圖2(d)所示。

2.2.3 硫酸銅和馬度米星銨聯合暴露對鯽魚肝臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

如圖3(a)所示，染毒第7天，Cu1+MAD1組SOD活性顯著高于對照組(P<0.01)；染毒第21天，Cu2+MAD2組SOD活性顯著低于對照組(P<0.01)。染毒第7天，Cu1+MAD1組CAT活性顯著高于對照組(P<0.01)，如圖3(b)所示。染毒第21天，Cu2+MAD2組GPx活性顯著低于對照組(P<0.01)，如圖3(c)所示。如圖3(d)所示，Cu1+MAD1和Cu2+MAD2組MDA含量均高于對照組；第21天，染毒組MDA含量顯著高于對照組(P<0.01)。

圖1 硫酸銅單一暴露對鯽魚肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx) 活性和丙二醛(MDA)含量的影響注：Cu1代表0.01 mg·L-1 CuSO4處理組，Cu2代表0.14 mg·L-1 CuSO4處理組，下同；與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，n=6。Fig. 1 Effects of single copper sulphate exposure on the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and malondialdehyde (MDA) content in the liver of Carassius auratusNote: Cu1 means 0.01 mg·L-1 CuSO4 treatment group; Cu2 represents 0.14 mg·L-1 CuSO4 treatment group; the same below; *indicates significant difference at 0.05 level compared with control group (P<0.05), n=6.

2.3 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚肝臟抗氧化基因表達的影響

2.3.1 硫酸銅單一暴露對鯽魚肝臟抗氧化基因表達的影響

染毒期間，各組sod的mRNA相對表達量無顯著變化(P>0.05)，如圖4(a)所示。如圖4(b)所示，染毒第7天，Cu2組cat的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)；染毒第21天，Cu1組cat的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)，Cu2組cat的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.01)。試驗期間，各組gpx的mRNA相對表達量均低于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)，如圖4(c)所示。

圖2 馬度米星銨單一暴露對鯽魚肝臟SOD、CAT、GPx活性和MDA含量的影響注：MAD1代表0.03 mg·L-1馬度米星銨處理組，MAD2代表0.42 mg·L-1馬度米星銨處理組，下同；與對照組比， *表示差異顯著(P<0.05)，**表示顯著差異(P<0.01)，n=6。Fig. 2 Effects of single maduramicin exposure on SOD, CAT, GPx activity and MDA content in the liver of Carassius auratusNote: MAD1 represents 0.03 mg·L-1 maduramicin treatment group; MAD2 indicates 0.42 mg·L-1 maduramicin treatment group; the same below; compared with the control group, *indicates a significant difference (P<0.05), **indicates a significant difference (P<0.01), n=6.

表3 硫酸銅與馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚的急性毒性Table 3 Acute toxicity of single and combined exposure of copper sulphate and maduramicin on Carassius auratus

2.3.2 馬度米星銨單一暴露對鯽魚肝臟抗氧化基因的影響

試驗期間，各組sod和gpx的mRNA相對表達量上下波動，與對照相比無顯著變化(P>0.05)，如圖5(a)和圖5(c)所示。如圖5(b)所示，各組cat的mRNA相對表達量均低于對照組，其中第21天，MAD2組cat的mRNA相對表達量與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。

2.3.3 硫酸銅和馬度米星銨聯合暴露對鯽魚肝臟抗氧化基因表達的影響

試驗期間，各聯合處理組sod和gpx的mRNA相對表達量上下波動，與對照相比無顯著變化(P>0.05)，如圖6(a)和圖6(c)所示。由圖6(b)可知，Cu2+MAD2組cat的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。

2.4 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚血生化的影響

硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚血生化的影響如表4所示。染毒第21天，MAD2和Cu2+MAD2組ALT活性顯著高于對照組(P<0.05)；其他染毒組與對照相比無顯著差異(P>0.05)。染毒第21天，Cu2組AST活性最高，顯著高于Cu1和對照組(P<0.05)。染毒第21天，Cu2+MAD2組ALP活性顯著高于對照組(P<0.05)。

2.5 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚紅細胞微核率的影響

由表5可知，硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合染毒均誘導鯽魚紅細胞微核率上升，并且隨著劑量增加而升高。Cu2和Cu2+MAD2組紅細胞微核率顯著高于對照組(P<0.01)；MAD2組紅細胞微核率顯著高于對照組(P<0.05)；Cu2+MAD2組紅細胞微核率顯著高于Cu2、MAD2和Cu1+MAD1組(P<0.01)。

2.6 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚肝細胞的DNA損傷

如圖7所示，對照組中，鯽魚肝細胞DNA圖像為規則的圓形，沒有拖尾現象。隨著硫酸銅和馬度米星銨濃度的增加，細胞DNA出現斷裂，整體結構變得松散，頭部DNA集中，尾部由DNA斷片組成，呈現類似彗星的圖像。隨著濃度升高，熒光強度變大且彗星尾部變長。高濃度復合染毒組中彗星尾部大于單獨暴露組，說明復合暴露對鯽魚肝細胞DNA損傷更為嚴重。

圖4 暴露于硫酸銅中的鯽魚肝臟sod、cat和gpx的mRNA相對表達量注：與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示顯著差異(P<0.01)，n=6。Fig. 4 The relative mRNA level of sod, cat and gpx in the liver of Carassius auratus exposed to copper sulphateNote: Compared with the control group, *indicates a significant difference (P<0.05), **indicates a significant difference (P<0.01), n=6.

表4 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對鯽魚血生化的影響Table 4 Effects of single and combined exposure of copper sulphate and maduramicin on blood biochemistry of Carassius auratus

圖5 暴露于馬度米星銨溶液中的鯽魚肝臟sod、cat和gpx的mRNA相對表達量注：與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，n=6。Fig. 5 The relative mRNA level of sod, cat and gpx in the liver of Carassius auratus exposed to maduramicinNote: *mean significant difference at 0.05 level compared with control group (P<0.05), n=6.

表5 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯合暴露對 鯽魚紅細胞微核率的影響Table 5 Effects of single and combined exposure of copper sulphate and maduramicin on the micronucleus rate of erythrocytes of Carassius auratus

如圖8所示，鯽魚肝細胞DNA彗星圖像的尾部DNA百分比、尾距、尾部長度和Oliver尾距隨著硫酸銅和馬度米星銨劑量升高均增高。Cu2、MAD2和Cu2+MAD2組上述指標均顯著高于對照組(P<0.01)。

3 討論(Discussion)

3.1 硫酸銅和馬度米星銨單一與聯合暴露對鯽魚的急性毒性

本研究中，硫酸銅對(146±15) g鯽魚的96 h-LC50為3.6 mg·L-1，按魚類急性毒性標準，Cu2+對鯽魚為高等毒性。文獻報道，Cu2+對(2.58±0.27) g豐產鯽的96 h-LC50為0.085 mg·L-1[26]，Cu2+對(13.2±0.8) g黃河鯉的96 h-LC50為1.12 mg·L-1[27]，Cu2+對(1.95±0.53) g棕二須魮的96 h-LC50為7.5 mg·L-1[28]。由此可見，不同種屬試驗動物的日齡和體質量對Cu2+毒性反應差異較大，但均表明高濃度Cu2+對魚類產生嚴重的毒性效應。馬度米星銨對鯽魚的96 h-LC50為11.22 mg·L-1(數據尚未發表)，低于其對斑馬魚的96 h-LC50(13.33 mg·L-1)，均為高等毒性。當二者聯合暴露時，其96 h-LC50進一步降低至1.4 mg·L-1和4.2 mg·L-1，采用相加指數法評價二者聯合毒性為協同作用。評價聯合毒性的方法很多，不同的評價手段可能造成不同的結果[29]。Markering相加指數法常與時間結合以觀察相互作用的變化，是目前水生毒理學研究中較為常用的一種方法[30]。截至目前，尚未有Cu2+和馬度米星銨對水生動物聯合毒性的報道，對于其他種屬水生動物的聯合毒性亦值得深入研究。

圖6 暴露于硫酸銅和馬度米星銨溶液中的鯽魚肝臟sod、cat和gpx的mRNA相對表達量注：與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，n=6。Fig. 6 The relative mRNA levels of sod, cat and gpx in the liver of Carassius auratus exposed to copper sulphate and maduramicinNote: *means significant difference at 0.05 level compared with control group (P<0.05), n=6.

圖7 硫酸銅和馬度米星銨暴露對鯽魚肝細胞DNA損傷的影響注：(a) 空白對照組；(b) 0.03 mg·L-1馬度米星銨；(c) 0.01 mg·L-1硫酸銅；(d) 0.03 mg·L-1馬度米星銨+0.01 mg·L-1硫酸銅； (e) 0.42 mg·L-1馬度米星銨；(f) 0.14 mg·L-1硫酸銅；(g) 0.42 mg·L-1馬度米星銨+0.14 mg·L-1硫酸銅。Fig. 7 Effects of copper sulphate and maduramicin exposure on DNA damage of Carassius auratus liver cellsNote: (a) negative control group; (b) 0.03 mg·L-1 maduramicin; (c) 0.01 mg·L-1 copper sulfate; (d) 0.01 mg·L-1 copper sulfate+0.03 mg·L-1 maduramicin; (e) 0.42 mg·L-1 maduramicin; (f) 0.14 mg·L-1 copper sulfate; (g) 0.14 mg·L-1 copper sulfate+0.42 mg·L-1 maduramicin.

圖8 硫酸銅和馬度米星銨暴露對鯽魚肝臟細胞DNA損傷的定量分析注：不同小寫字母表示各處理組之間的顯著差異(P<0.05)，不同大寫字母表示各處理組之間的顯著差異(P<0.01)，n=6。Fig. 8 Quantitative analysis of DNA damage of Carassius auratus liver cells induced by copper sulphate and maduramicinNote: Different lower case letters indicate significant differences between treatment groups (P<0.05), and different upper case letters indicate significant differences between treatment groups (P<0.01), n=6.

3.2 硫酸銅和馬度米星銨單一或聯合暴露對鯽魚的亞急性毒性

為進一步認識Cu2+和馬度米星銨二者聯合暴露對鯽魚的亞急性毒性，本研究選取二者聯合染毒96 h-LC50的1/10和1/140進行亞急性毒性試驗。研究顯示，Cu2+和馬度米星銨可影響ALT、AST和ALP的活性，當機體肝組織發生中毒、炎癥等情況時，血液中ALT與AST濃度升高[31]。ALP廣泛分布于肝臟、腸、腎和骨等組織，是參與機體去磷酸化和磷酸化反應的非特異性表達酶[32]。肝組織受到損傷時，血清中ALP活性增強[33]。提示Cu2+和馬度米星銨對肝臟有損傷作用，然而聯合染毒組上述指標與單一染毒組相比并無顯著差異，表明ALT、AST和ALP尚不能作為評價Cu2+和馬度米星銨的聯合毒性的生物標志物。

SOD是一類廣泛分布于生物體內的金屬酶，其活力可間接反映機體清除氧自由基的能力[34]。本研究發現，高濃度Cu2+與馬度米星銨聯合暴露導致SOD活性在染毒第21天顯著降低，而高濃度馬度米星銨暴露可在一定程度升高SOD活性，提示Cu2+單一及聯合染毒時，對鯽魚肝臟毒性超過機體承受能力，SOD活性受到抑制，從而對機體造成毒害作用[35]。而馬度米星銨對鯽魚肝臟的毒性小于Cu2+和聯合染毒組，機體可通過升高SOD活性減緩氧化損傷。CAT是生物體內重要的酶，主要通過減少過氧化氫含量降低有害物質對機體的損傷[36]。本研究發現，單一及聯合染毒組的CAT活性均呈下降趨勢，說明Cu2+和馬度米星銨會抑制CAT活性，降低機體清除過氧化氫的能力，使機體受到過氧化氫的毒害。GPx也是組成抗氧化系統中的一種酶，其功能是將機體內的過氧化物轉換成水等無害物質[37-38]，本研究發現各組GPx的活性整體呈下降趨勢，說明Cu2+和馬度米星銨可通過破壞抗氧化系統，進而對機體造成氧化損傷。MDA是機體內脂質過氧化產物[39]，MDA含量越高，機體受到的氧化損傷程度越高。本研究發現，Cu2+與馬度米星銨單一和聯合暴露呈濃度依賴性地升高鯽魚肝臟中的MDA含量，但聯合暴露組MDA含量和單一暴露組相比無顯著差異，不能由此判斷Cu2+和馬度米星銨聯合毒性作用的類型?！稘O業水質標準》(GB 11607—89)[40]要求水環境中Cu2+的濃度不能高于0.01 mg·L-1，本試驗Cu2+對鯽魚染毒的低劑量為0.01 mg·L-1，研究發現，染毒后第21天，低濃度Cu2+顯著抑制catmRNA的表達，提示鯽魚長期暴露于低濃度Cu2+會受到氧化損傷，應當加強環境監控力度，以保護生態環境安全。

3.3 硫酸銅和馬度米星銨單一或聯合暴露對鯽魚細胞微核和DNA損傷的影響

水中有害物質會影響魚的造血器官，導致紅細胞染色體畸變甚至斷裂[41]，當血液干細胞分裂形成新細胞時，殘留于紅細胞質內的斷片形成微核[42]。魚吸收了重金屬等致突變物后，其外周血紅細胞產生的微核數目與致畸物濃度呈正比。因此，可通過檢測魚類外周血紅細胞微核數來評價水環境的污染狀況[43-44]。彗星試驗是快速檢測單細胞DNA損傷的方法[7]。

研究表明，斑馬魚持續14 d暴露于0.5 mg·L-1的馬度米星銨溶液中，紅細胞微核率為(337±21.66)‰，是對照組的43.9倍[15]。有研究表明，將鯽魚置于0.02 mg·L-1的Cu2+溶液中7 d后，紅細胞微核率是對照組的6.3倍[45]。本研究中高濃度馬度米星銨和Cu2+組微核率分別是對照組的6.2倍和18.7倍，這種差異可能由試驗動物及染毒時間不同所致。高濃度的Cu2+和馬度米星銨可明顯損傷鯽魚肝細胞DNA，推測Cu2+和馬度米星銨對鯽魚的毒害作用，導致細胞內產生大量的活性氧(ROS)，損害細胞內的核糖、氨基酸和蛋白質等物質，最終導致DNA鏈的斷裂，造成DNA損傷[46]。高濃度聯合染毒組紅細胞微核率和肝細胞尾部DNA百分比顯著高于單獨染毒組，表明高濃度Cu2+和馬度米星銨聯合暴露對鯽魚的遺傳毒性高于單一暴露。

綜上所述，Cu2+和馬度米星銨對鯽魚的聯合暴露急性毒性高于單一暴露，表現為協同作用；環境濃度下的Cu2+和一定濃度的馬度米星銨單一及聯合暴露均可引起一定程度的血液毒性和肝臟氧化損傷；Cu2+與馬度米星銨聯合暴露可顯著誘導細胞微核和肝臟細胞DNA損傷，其遺傳毒性高于單一暴露。養殖水體或自然水體環境中應加強Cu2+和馬度米星銨的復合污染的監控與處理，以保障水生態安全及水產養殖健康發展。