降糖消渴顆粒對糖尿病小鼠肝臟糖原儲備量及糖代謝相關基因表達的影響*

張毅，趙丹丹，莫芳芳，高思華

（1.北京開放大學，北京 100081；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

2型糖尿病（T2DM）是與遺傳、環境污染、免疫、年齡、生活方式等多因素密切相關的內分泌代謝性疾病之一，在全球的發病率呈持續升高趨勢[1-2]。隨著人口老齡化的加劇和肥胖人群的增多，再加之巨大的人口基數，目前中國已居T2DM人數高發國家前列[3]。肝臟是人體內參與糖類代謝的重要器官之一，血液中的胰島素可以與肝臟胰島素受體底物-2（IRS-2）結合促進肝臟合成糖原，減少肝糖的輸出，以降低循環系統中葡萄糖的含量，從而維持正常血糖水平[4]。胰島素抵抗在T2DM繼發肝臟合成糖原功能異常環節中起著非常重要的作用。在胰島素抵抗狀態下，肝臟儲備糖原能力降低，糖異生作用加強，葡萄糖輸出增多，循環系統中葡萄糖含量增加，T2DM患者的血糖水平升高[5-7]。

降糖消渴顆粒是以《黃帝內經》中關于“消渴病”病因病機的論述為理論指導，結合導師多年的臨床經驗創制而成的治療糖尿病的方劑，由丹參、生地黃、黃連、茯苓、山萸肉、生曬參等10味藥組成，組方旨在肝、脾、腎3臟同調。根據糖尿病的發病特點，以疏肝、健脾、固腎為本，兼以清熱燥濕、益氣升陽，臨床根據所病臟腑的先后順序靈活調整方中藥物的劑量，效果顯著[8-9]。同時，該方經前期基礎實驗研究證實具有良好的改善胰島素抵抗、降低血糖、延緩或逆轉糖尿病靶器官輕度損傷的作用[10-13]。

本實驗選用自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠為研究對象，以高脂飼料喂養誘導發病，模擬人類T2DM發病中遺傳因素、飲食不節等病因，探討降糖消渴顆粒對糖尿病小鼠肝臟糖原合成及儲備能力的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性8周齡KK-Ay小鼠、C57BL/6J小鼠，均由北京華阜康生物科技有限公司[許可證號SCXK（京）2012-0001]提供，飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室 [合格證號SCXK（京）2011-0024]，實驗室環境溫度22～24℃，相對濕度（40±10）%，12/12 h 光照/黑暗循環，飼養期間，動物自由進食、飲水。高脂飼料（20%蔗糖、2.5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鈉、66.5%基礎飼料）及普通飼料由北京科澳協力飼料有限公司。本動物實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物 降糖消渴顆粒及制備方法詳見前期研究文獻[10-13]，規格：每克顆粒含5.01 g生藥。吡格列酮片由北京太洋藥業有限公司生產。

1.3 主要儀器與試劑 光學顯微鏡（日本奧林帕斯）、Trizol試劑（美國 Invitrogen公司）、SYBR Mix試劑盒（美國ABI公司）、引物設計合成（上海生物工程有限公司）、Carnoy固定液（無水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷3種試劑，配置體積比例為6∶1∶3，使用前將三者混勻，分裝入各標記離心管中，現用現配）、50 mL過碘酸溶液（稱取0.4 g過碘酸，加入10 mL去離子水中混合為A液，95%乙醇35 mL與0.2 mol/L醋酸鈉5 mL混合為B液，使用前將A液加入B液中充分混勻）、Schiff反應劑（稱取1 g堿性品紅加入盛有200 mL加熱至沸的去離子水的三角瓶中，攪拌至溶解，繼續加熱10 min，冷卻至50℃后過濾，緩緩加入20 mL濃鹽酸，冷卻至室溫后加入1 g無水偏重亞硫酸鈉，密封瓶口，室溫避光處放置2 d至成熟，4℃冰箱保存）。若有色可加入1 g活性炭后過濾使用。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組給藥方法 KK-Ay小鼠40只，C57BL/6J小鼠8只，適應性飼養1周后給予KK-Ay小鼠高脂飼料飲食造模，C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養。繼續飼養4周，禁食12 h后檢測KK-Ay小鼠空腹血糖，以空腹血糖≥13.9 mmol/L為糖尿病小鼠成模標準。將糖尿病小鼠按照血糖水平及體質量隨機分為模型組，吡格列酮組，降糖消渴顆粒高（7.00 g/kg）、中（3.50 g/kg）、低（1.75 g/kg）劑量組，每組8只。中劑量由人鼠等效劑量換算得出，高、低劑量分別是人鼠等效劑量的2倍和0.5倍。降糖消渴顆粒治療各組實驗小鼠給予等體積，不同濃度中藥混懸液灌胃，吡格列酮組實驗小鼠給予劑量計算方法如下：給藥劑量=6.5 mg/kg體質量×給藥體積（0.1 mL/10 g體質量），模型組和正常組予等體積蒸餾水灌胃。治療周期為10周，各組實驗動物飼養延續造模期間飲食模式，期間于每日上午灌胃1次。

2.2 檢測指標與方法

2.2.1 攝食量及體質量增長率檢測 給藥的0～10周期間，于每周同一時間段記錄小鼠攝食量；于第0周和第10周稱取小鼠體質量，計算體質量增長率。公式如下：體質量增長率=（治療后體質量-治療前體質量）/治療前體質量。

2.2.2 采用過碘酸雪夫染色法檢測肝臟中糖原情況 動物麻醉后開腹，摘取肝臟，取相同部位肝組織，放入Carnoy固定液中固定至少4 h，余下肝組織液氮保存備用。固定后的肝組織梯度濃度乙醇脫水，經二甲苯透明后石蠟包埋、切片、烘干；梯度濃度乙醇水化，浸入過碘酸液30 min后浸入Schiff液，室溫避光，待糖原顯色后沖洗、脫水、透明后中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察肝臟糖原分布情況。通過IOD/Area值計算肝糖原含量。

2.2.3 采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測肝臟糖代謝相關基因的表達 IRS-2引物上游序列：5′-CCA GTA AAC GGA GGT GGC TA-3′；下游引物序列：5′-GCT TAG GGT CTG GGT TCT CC-3′。AKT-1引物上游序列：5′-ATG TGG ATC AGC GAG AGT CC-3′；下游引物序列：5′-GCA GCG GAT GAT AAA GGT GT-3′。GSK-3α 引物上游序列：5′-TCT GAG CAA GCA GGT CTG TG-3′；下游引物序列：5′-TCT AGC ACG CAC ACC AAG TC-3′。剪取 5 mm×5 mm體積肝組織，應用Trizol法提取肝組織中的RNA，根據反轉錄試劑盒操作說明，將肝組織總RNA轉錄成單鏈cDNA，將反轉錄所得cDNA用DEPC水10倍稀釋后加入下述20 μL反應體系中：SYBR MIX（10 μL）+c DNA 模板（2 μL）+上/下游引物（各1 μL）+無核酸酶超純水（6 μL），每組取 4 個樣本，各樣本設2個復孔進行上樣。上樣后PCR膜封板，放入熒光定量PCR儀中進行擴增反應，反應條件如下：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95℃，15 s；60℃，60 s，40個循環，結束后4℃保存。擴增結果以Ct值表示，導出至EXCEL中，各樣本mRNA表達結果以樣本中β-actin的Ct值為基準進行標準化計算，得到相對表達量，結果用 2-ΔΔCt表示。ΔΔCt計算公式如下：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ctβactin）實驗組-（Ct目的基因-Ctβactin）對照組。

2.3 統計學方法 實驗結果用SPSS 19.0軟件進行數據分析處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05表示差異性具有統計學意義。使用Graph Pad Prism 6.0軟件繪制結果圖。

3 結果

3.1 降糖消渴顆粒對T2DM小鼠攝食量及體質量增長率的影響 如圖1所示，治療前，KK-Ay各組小鼠攝食量顯著高于正常組小鼠（P<0.01），組間無統計學差異（P>0.05）。在為期10周的治療過程中，小鼠飲食量雖無明顯增減（P>0.05），但每周都有所波動。攝食量曲線下面積顯示，KK-Ay小鼠攝食量明顯高于正常組小鼠（P<0.01），各KK-Ay小鼠的攝食量比較無差異（P>0.05）。各治療組均未明顯影響小鼠攝食量。

圖1 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠日均攝食量的影響（±s，n=8）Fig.1 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on daily food intake in mice of each group（±s，n=8）

如表1所示，各組小鼠體質量在治療結束后均有所增加，KK-Ay小鼠較正常小鼠增質量明顯（P<0.01），體質量增長率也有統計學差異（P<0.05）。但各治療組小鼠增質量情況及體質量增長率較模型組無統計學差異（P>0.05）。

表1 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠體質量增長率的影響（±s）Tab.1 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the rate of weight gain in mice of each group（±s）

表1 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠體質量增長率的影響（±s）Tab.1 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the rate of weight gain in mice of each group（±s）

注：正常組為C57BL/6J小鼠，其余為KK-Ay小鼠。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

分組正常組模型組吡格列酮組降糖消渴顆粒組動物數 劑量（g/kg）增質量（g）8 8 8 8體質量增長率（%）- 5.17±1.16** 20.27±2.77*- 11.00±4.33 31.14±4.12 0.006 5 9.21±0.79 26.31±2.56 7.00 11.83±1.87 33.64±6.01 3.50 9.34±2.11 26.82±5.17 1.75 9.66±1.41 27.86±2.88

3.2 降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟糖原含量的影響 如圖2所示，正常小鼠肝組織致密，細胞形態規則，門管區結構清晰，肝索排列有序，包漿中均勻散布大量紫紅色糖原顆粒。KK-Ay小鼠較正常小鼠肝組織內存在不等量脂肪性空泡，細胞形態腫脹，門管區結構改變，肝索排列紊亂，胞漿中散在分布紫紅色肝糖原顆粒。各治療組肝臟病理改變均有不同程度減輕，降糖消渴顆粒治療各組尤為明顯。

圖2 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟糖原儲備量的影響（PAS染色，×40）Fig.2 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver glycogen stores in mice of each group(PAS stain，×40)

如表2所示，KK-Ay小鼠經藥物治療后，肝臟糖原儲備能力均有不同程度增強，但吡格列酮組和高劑量降糖消渴顆粒組小鼠與模型組比無統計學意義（P>0.05），中劑量降糖消渴顆粒作用最佳（P<0.05）。

表2 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟內糖原儲備量的影響（±s）Tab.2 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver glycogen stores in mice of each group（±s）

表2 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟內糖原儲備量的影響（±s）Tab.2 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver glycogen stores in mice of each group（±s）

注：正常組為C57BL/6J小鼠，其余為KK-Ay小鼠。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

分組正常組模型組吡格列酮組降糖消渴顆粒組動物數5 5 5 5 5 5劑量（g/kg） IOD/Area-0.25±0.06**-0.51±0.02 0.006 5 0.53±0.06 7.00 0.62±0.14 3.50 0.65±0.05*1.75 0.39±0.06

3.3 降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟調控糖代謝相關基因表達的影響 如表3所示，與正常小鼠比較，模型組小鼠肝臟 IRS-2、Akt、GSK-3α mRNA 的表達均顯著上調（P<0.01）；與模型組比較，吡格列酮組、高、中劑量降糖消渴顆粒組IRS-2 mRNA的表達明顯升高（P<0.01），低劑量也可發揮一定作用（P<0.05）；在Akt mRNA的表達方面，吡格列酮組、中劑量組作用明顯（P<0.01），而在 GSK-3α mRNA的表達方面，中、高劑量降糖消渴顆粒則具有顯著優勢（P<0.01）。

表3 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟IRS-2、Akt、GSK-3αmRNA 表達的影響（±s）Tab.3 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver IRS-2，Akt，GSK-3αmRNA expressions in mice of each group（±s）

注：正常組為C57BL/6J小鼠，其余為KK-Ay小鼠。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

分組 IRS-2RQ AktRQ GSK-3αRQ動物數 劑量（g/kg）正常組 1.01±0.18** 1.01±0.13** 1.01±0.16**模型組 0.04±0.01 0.38±0.05 1.89±0.32吡格列酮組 0.21±0.06** 0.63±0.03** 1.56±0.27降糖消渴顆粒組 0.22±0.03** 0.46±0.12 1.19±0.15**0.27±0.11** 0.82±0.19** 1.37±0.28**0.16±0.06* 0.48±0.05 1.67±0.43 4 4 4 4 4 4- -0.006 5 7.00 3.50 1.75

4 討論

《素問·經脈別論》有云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調水道，下輸膀胱，水精四布，五經并行。”這段原文描述了食物進入胃內，通過脾氣“散精”的功能將飲食物中的精微物質布散至全身，與其他臟腑協同合作，發揮脾胃后天之本作用的過程。其間除脾臟功能的正常發揮起到決定性作用外，還需依賴肝主疏泄與腎主水液功能的正常。糖類、脂肪、蛋白質三大營養物質均屬于中醫“水谷精微”范疇，正常情況下負責為機體維持生命活動提供能量[14]。在糖尿病狀態下，肝脾腎3臟功能的失調導致水谷精微物質無法正常流轉，在體內積聚成痰濁、瘀血等病理產物，堆積日久化熱反過來影響三臟功能，進一步加劇糖尿病的糖脂代謝紊亂狀態[15]。

肝糖原是機體內葡萄糖的有效儲存形式之一，糖異生及肝臟內糖原合成是機體血糖的重要來源和消耗途徑，肝糖原的合成減少或分解增多都會引起血糖升高，與糖尿病的糖代謝紊亂密切相關[16]。IRS-2是胰島素信號通路的重要信號蛋白之一，在肝臟中大量表達，可促進肝糖原的合成及抑制肝臟中葡萄糖的輸出，其功能異常不僅會減少肝糖原的合成，還會減弱肝臟對葡萄糖輸出的抑制作用，產生糖代謝的障礙[17-18]。蛋白激酶B（PKB）是胰島素信號通路中的關鍵因子，調控機體糖代謝的關鍵酶，可阻止肝臟的糖異生作用[19]，還可抑制糖原合成酶激酶-3α（GSK-3α）活性，從而使糖原合成酶活性增強，糖原合成量增加，起到降低血糖的作用[20]。GSK-3α是介導糖原合成的關鍵酶[21]，受胰島素調控，可磷酸化糖原合成酶使其失活，負反饋調節糖原合成，維持體內葡萄糖的相對穩態。肝組織內GSK-3α mRNA表達的減少可降低對糖原合成酶的抑制作用，導致糖原合成酶活化，促進肝細胞攝取利用血液中的葡萄糖，合成肝糖原儲存在肝臟中，從而起到降低血糖，緩解體內糖代謝異常的作用[22-23]。降糖消渴顆粒發揮其降糖效應的可能機制之一是通過提高肝臟的糖原合成能力，促進血糖向肝糖原轉化的作用實現的。

本實驗中高、中劑量降糖消渴顆粒對糖尿病小鼠的食欲均有不同程度的抑制作用，中、低劑量降糖消渴顆粒還具有降低糖尿病小鼠體質量增長率的趨勢，這說明降糖消渴顆粒調節糖代謝的途徑之一可能是在一定程度上改善糖尿病的“多食”狀態，以減少血糖的來源。在肝臟胰島素信號通路方面，各劑量降糖消渴顆粒通過上調實驗小鼠肝臟胰島素信號通路中IRS-2的表達來促進肝臟對葡萄糖的攝取和利用，合成肝糖原并抑制肝臟葡萄糖的輸出；中劑量同時上調Akt的表達來減少肝臟糖異生，調節糖代謝。在肝臟糖原儲備方面，糖尿病小鼠肝臟發生了不同程度的脂肪化變性，破壞了細胞正常結構，肝糖原合成及儲存能力遭到破壞。結合IOD/Area值可以看出，經吡格列酮及高、低劑量降糖消渴顆粒治療后的糖尿病小鼠肝糖原變化不明顯，而中劑量體現出了增加肝糖原含量的優勢。除此之外，高、中劑量降糖消渴顆粒明顯下調了肝組織中GSK-3α的mRNA表達，負反饋活化糖原合成酶，肝臟合成糖原能力增強。但本實驗中正常組小鼠肝糖原含量低于各組糖尿病小鼠，這可能是由于基礎飼料和高脂飼料營養物質含量的差異性引起的。

綜上所述，中劑量降糖消渴顆粒可以減少攝入體內的葡萄糖；增加肝臟中IRS-2和調節機體糖代謝關鍵酶Akt的表達，以減少糖異生，與此同時下調GSK-3α的表達，促進葡萄糖轉化成肝糖原儲存在肝臟中。