女貞子多糖抗去勢小鼠骨質疏松作用研究*

韋秋，侯佳華，覃小燕，楊云，安然，毛浩萍

（天津中醫藥大學中醫藥研究院，方劑學教育部重點實驗室，天津 301617）

絕經期骨質疏松是一種以骨量減少和骨微觀結構變化導致骨密度降低及骨脆性增加的代謝性骨病[1]，已成為世界上常見的老年疾病之一。破骨細胞為唯一行使骨吸收功能的細胞，在維持骨代謝平衡中發揮重要作用[2]。目前國內外抗骨質疏松的藥物以抑制破骨細胞為主[3-4]。女貞子常用于骨質疏松癥的治療[5]，藥理研究發現女貞子中的女貞苷、特女貞苷、女貞苷Gl3、油女貞苷、紅景天苷、齊墩果酸和熊果酸均具有抗骨質疏松作用[6-7]。但尚未見女貞子多糖對骨質疏松的影響，本研究旨在研究女貞子多糖對去卵巢所致骨質疏松的影響，為女貞子多糖用于骨質疏松癥的治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級8周齡雌性C57BL/6小鼠40只，購于北京斯貝福實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0002，動物飼養于中國中醫科學院放射醫學研究所，飼養溫度為20～25℃，濕度為40%～70%，自由進食和飲水。

1.2 藥物 女貞子藥材1 kg，80%乙醇加熱回流提取兩次（料液比），每次2 h，藥渣揮干乙醇，水提取（90 ℃，2 h，1∶10），提取兩次，提取液減壓濃縮，乙醇醇沉，調節乙醇終濃度為80%，4℃靜置過夜，得沉淀即為女貞子多糖，提取率約為6.4%。結合雌激素片（紅利來），新疆新姿源生物制藥有限責任公司生產。

1.3 試劑和儀器 無機磷（P）、鈣（Ca）全自動生化儀試劑盒，深圳邁瑞生物醫療股份有限公司生產；雌二醇酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，天津安諾瑞康生物技術有限公司；三溴乙醇，Sigma公司；α-MEM培基，Gibico公司；胎牛血清，BioInd公司；抗生素（青霉素、鏈霉素），BioInd公司；Ficoll-Paque PREMIUM sterile solution，GE Healthcare公司；巨噬細胞集落刺激因子（MCSF），R&D systems公司；核因子κB受體活化因子配體（RANKL），R&D systems公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學研究所；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒，碧云天生物技術有限公司；萬分之一天平（PTX-FA110S），福州華志科學儀器有限公司生產；全自動生化儀（BS240），深圳邁瑞生物醫療股份有限公司生產；雙能射線骨密度儀（UltraFous DXA），FaxitronBioptics；微計算機斷層掃描技術（micro CT，VivaCT40），SCANCO Medical AG公司；多功能讀板儀（Spark），TECAN公司等。

2 方法

2.1 去勢骨質疏松小鼠模型制備 適應性喂養1周后，將小鼠按照隨機數字表法隨機分為兩組其中假手術組8只，造模組32只。腹腔注射1.5%三溴乙醇，每只0.18 mL，造模組進行雙側卵巢摘除術，假手術組摘除雙側卵巢周圍脂肪組織，術后連續腹腔注射2萬單位青霉素，連續注射3 d。

2.2 分組與給藥 造模15 d后眼眶取血約100 μL，假手術組（Sham）和造模組各取8只。隨后將32只卵巢摘除小鼠隨機分為模型組（OVX），雌激素組（Estrogen，0.039mg/kg）、女貞子多糖3g/kg組（FLLP，3 g/kg）和女貞子多糖 6 g/kg組（FLLP，6 g/kg）。按0.1 mL/10 g灌胃給藥，每日1次，連續給藥8周，其中假手術組和模型組給對應體積的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液。每周記錄1次小鼠體質量。

2.3 動物取材

2.3.1 股骨及臟器分離 最后1次給藥結束后，腹腔注射1.5%三溴乙醇（0.1 mL/10 g），在冰上取出小鼠肝、脾、腎、子宮并稱質量，計算臟器指數（以臟器質量/體質量表示）；取小鼠后肢雙側股骨并去除肌肉組織，在4%多聚甲醛中固定。用雙能射線骨密度儀掃描分析股骨骨密度，用microCT掃描分析股骨骨微結構。

2.3.2 血漿樣本 摘眼球取血，置于提前用肝素鈉處理的1.5 mL小型離心管中，靜置30 min，1 300×g離心15 min，取血漿分裝于200 μL小型離心管中保存。用BS240全自動生化分析儀檢測血漿中Ca、P和堿性磷酸酶（ALP）水平。

2.4 骨髓來源單個核細胞分離與破骨細胞誘導分化

2.4.1 骨髓來源單個核細胞分離與純化 將4周齡C57BL/6J雌鼠脫頸處死并在75%乙醇浸泡5min后，在生物安全柜中分離雙側后肢股骨和脛骨，完全去盡肌肉組織與結締組織，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）吹出骨髓，用Ficoll-Paque PREMIUM sterile solution進行密度梯度離心后使用紅細胞裂解液裂解紅細胞。250×g離心15 min獲得單個核細胞。將細胞用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養基接種于T25培養瓶中。24 h后，取未貼壁的細胞即可獲得純度較高的骨髓來源單個核細胞。

2.4.2 女貞子多糖對破骨前體細胞活性的影響 將骨髓來源單個核細胞（3×104個/孔）接種到96孔板中，用含25 μg/L MCSF和10%FBS的α-MEN完全培養基培養3 d。隨后繼續用含25 μg/L MCSF的完全培養基培養，同時給予不同濃度的女貞子多糖（1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL）干預培養 5 d，第 3 天時更換培養液。培養結束后吸棄培養基，加入100 μL用α-MEN基培稀釋的CCK8溶液，37℃避光孵育2 h，在450 nm處檢測吸光度，觀察女貞子多糖對破骨前體細胞活性的影響。

2.4.3 女貞子多糖對破骨細胞分化的影響 將骨髓來源單個核細胞（3×104個/孔）接種到96孔板中，用含25 μg/L MCSF和10%FBS的α-MEN完全培養基培養3 d。隨后用含25 μg/L MCSF和50 μg/L RANKL的培養液誘導破骨細胞分化。不同濃度的女貞子多糖（1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL）干預培養5 d，第3天時更換培養液。誘導培養結束后檢測培養上清中TRAP的含量，觀察女貞子多糖對破骨細胞分化的影響。

2.5 統計學方法 使用SPSS 24.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 女貞子多糖對體質量、臟器系數的影響 圖1A所示，造模15 d后血漿中雌二醇的含量顯著降低（P<0.05），提示模型成功建立。給藥8周后，與假手術相比，模型組體質量、脾臟指數、腎臟指數、子宮指數均有統計學差異（P<0.05，表1和圖1C），肝指數未見統計學差異（P＞0.05，表1）。與模型組相比，雌激素組和女貞子多糖3g/kg組腎系數顯著升高（P<0.05，表1）；雌激素組子宮系數顯著升高（P<0.05，表1），但女貞子多糖3 g/kg和6 g/kg組多子宮系數均未見統計學差異（P＞0.05，表1）；女貞子多糖不同劑量組體質量和肝系數均未見統計學差異（P＞0.05，表1、圖1B和圖1C）。

圖1 女貞子多糖對去勢小鼠體質量的影響（±s）Fig.1 The effect of FLLP on the body weight of ovariectomized mice（±s）

表1 女貞子多糖給藥8周對去勢小鼠臟器的影響（±s）Tab.1 Effects of FLLP administered for 8 weeks on the organs of ovariectomized mice（±s）

表1 女貞子多糖給藥8周對去勢小鼠臟器的影響（±s）Tab.1 Effects of FLLP administered for 8 weeks on the organs of ovariectomized mice（±s）

注：Sham：假手術組，OVX：模型組，Estrogen：雌激素組，FLLP：女貞子多糖；與 Sham 相比，#P<0.05；與 OVX 相比，*P<0.05。

組別 肝臟指數 脾臟指數 腎臟指數 子宮指數Sham 0.041 8±0.005 1 0.005 8±0.001 2 0.011 3±0.000 9 0.002 9±0.001 1 OVX 0.041 9±0.003 6 0.004 0±0.000 7# 0.009 9±0.000 6# 0.001 1±0.000 4#Estrogen（0.039 mg/kg） 0.045 6±0.006 0 0.003 4±0.000 4 0.011 2±0.000 4* 0.002 3±0.000 7 3 g/kg FLLP 0.041 0±0.003 9 0.003 5±0.000 3 0.010 7±0.000 8* 0.001 3±0.000 1 6 g/kg FLLP 0.039 5±0.002 0 0.003 7±0.000 6 0.010 4±0.000 7 0.001 3±0.000 6

3.2 女貞子多糖對小鼠股骨骨密度及骨微結構的影響 雙能射線結果顯示，與假手術組比，給藥8周后模型組小鼠股骨骨密度顯著降低（P<0.05，圖2A）；與模型組比，給雌激素和不同劑量女貞子多糖8周后小鼠股骨骨密度顯著升高，具有統計學意義（P<0.05，圖2A）。microCT結果顯示，與假手術組比，給藥8周后模型組小鼠股骨干骺端骨小梁數目（Tb.N）和骨體積分數（BV/TV）顯著降低（P<0.05，圖2B和圖2C），而骨小梁分離度（Tb.Sp）顯著升高（P<0.05，圖2D）；與模型組相比，3 g/kg和 6 g/kg女貞子多糖組Tb.N顯著升高（P<0.05，圖2B），3 g/kg女貞子多糖和雌激素組BV/TV顯著升高（P<0.05，圖2C），3 g/kg和6 g/kg女貞子多糖組Tb.Sp顯著降低（P<0.05，圖2D）。結果顯示3 g/kg和6 g/kg女貞子多糖能明顯改善去勢所致的骨流失和骨微結構破壞。

圖2 女貞子多糖給藥8周對去勢小鼠股骨骨密度和骨微結構的影響（±s）Fig.2 Effect of FLLP administration for 8 weeks on bone mineral density and bone microstructure of ovariectomized mice（±s）

3.3 女貞子多糖對血漿中Ca、P水平的影響 與假手術組相比，模型組血漿中Ca、P均顯著升高（P<0.05，圖3A-B）。與模型組相比，雌激素和不同劑量女貞子多糖均能顯著降低小鼠血漿中Ca水平（P<0.05，圖3A）；6 g/kg女貞子多糖能顯著降低小鼠血漿中P的含量（P<0.05，圖3B）。

圖3 女貞子多糖給藥8周對去勢小鼠血漿中Ca、P水平的影響（±s）Fig.3 The effect of FLLP administration for 8 weeks on the plasma Ca and P levels in ovariectomized mice（±s）

3.4 女貞子多糖對骨髓來源的單個核細胞向破骨細胞分化的影響 CCK-8 結果顯示，1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL女貞子多糖對破骨前體細胞活性無顯著影響（P＞0.05，圖4A）。TRAP結果顯示，與對照組相比，模型組的培養上清中TRAP酶活性顯著升高（P<0.05，圖4B）。與模型組相比，1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL女貞子多糖組的培養上清中TRAP酶活性顯著降低（P<0.05，圖4B）。提示 1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL女貞子多糖顯著抑制骨髓來源的單個核細胞向破骨細胞分化。

圖4 女貞子多糖對骨髓來源的單個核細胞向破骨細胞分化的影響（±s）Fig.4 The effect of FLLP on the differentiation of bone marrow-derived mononuclear cells into osteoclasts（±s）

4 討論

隨著老齡化的加劇，骨質疏松癥的患病率逐漸升高。有研究發現骨密度下降分為40～59歲、60～69歲及70歲以上3個年齡段，其中前兩個階段的下降幅度最明顯[8]。女性骨質疏松患病率明顯高于男性，由于絕經后體內雌激素水平顯著下降，對破骨細胞的抑制作用減弱，導致骨密度降低。不同年齡階段絕經后婦女的骨質疏松癥患病率高達21.2%～70.5%[9]。骨質疏松性骨折是其最嚴重的并發癥之一，具有較高的致畸和致殘率，嚴重影響患者生活質量[10-12]。骨質疏松癥的防治已成為全球關注和研究的熱點之一。中醫認為骨質疏松癥屬于“骨痹”“骨痿”和“骨枯”的范疇，病變在骨，病位在腎，與肝脾胃緊密相關，以補腎填精、健脾和胃和血化瘀為治則[13]。

女貞子具有滋陰補腎的作用，其含有三萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、多糖類、揮發油等成分[14-17]。女貞子在臨床上常用于骨質疏松癥的治療，現代藥理研究表明女貞子及其成分女貞苷、特女貞苷、齊墩果酸和熊果酸等可通過激活Wnt/β-catenin/LRP6通路，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化；抑制NFATC1/RANKL信號通路抑制破骨細胞分化；促進小腸及十二指腸中鈣重吸收以及升高骨組織中Ca和P的含量，調控骨代謝等多種途徑發揮抗骨質疏松作用[7，18-21]。但是女貞子多糖對骨質疏松的作用未見相關報道。戰興曉等[22]研究發現女貞子多糖的重均相對分子質量為10 721，數均相對分子質量為10 673，其由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖3種單糖組成，其物質的量比 9.14∶8.10∶5.18。本研究采用經典的雙側卵巢摘除術復制骨質疏松小鼠模型，研究女貞子多糖對骨質疏松的作用。研究發現與假手術組相比，模型組小鼠子宮明顯萎縮，血漿中Ca、P水平顯著升高，股骨干骺端BMD、Tb.N及BV/TV顯著降低，Tb.Sp顯著升高，呈現骨質疏松癥中典型的骨丟失的特點。而給予女貞子多糖8周后能明顯改善去卵巢所致的骨密度降低和骨微結構，提示女貞子多糖具有潛在的抗骨質疏松作用。

破骨細胞是體內唯一行使骨吸收功能的細胞，抑制破骨細胞分化是目前臨床抗骨質疏松治療的主要手段之一。本研究使用MCSF和RANKL誘導骨髓來源單個核細胞向破骨細胞分化，同時給予女貞子多糖，觀察女貞子多糖對破骨細胞分化的影響。目前研究中藥多糖對破骨細胞分化的影響給藥劑量從 1×10-4mg/mL 到 1×10-1mg/mL 不等[23-24]。本研究女貞子多糖相關細胞實驗給藥濃度是綜合參考已發表多糖相關細胞實驗的基礎上，進行CCK-8細胞活力檢測以及破骨細胞分化相關預實驗后最終確定的女貞子多糖給藥劑量。首先，CCK-8實驗結果顯示 1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL 女貞子多糖對破骨前體細胞活性無顯著影響的（P>0.05），然后在MCSF和RANKL誘導破骨前體細胞向破骨細胞分化的同時給予上述劑量的女貞子多糖，5 d后檢測培養上清中TRAP活性，發現給予女貞子多糖處理后TRAP活性明顯降低，說明 1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL 女貞子多糖具有抑制骨髓來源的單個核細胞向破骨細胞分化的能力，而非抑制破骨前體細胞活力。

骨代謝平衡與體內鈣磷代謝關系密切[2，25-26]，因此調節鈣磷代謝對維持骨代謝平衡具有重要意義。體內實驗發現女貞子多糖可以降低血漿Ca和P水平，體外實驗發現女貞子多糖能抑制MCSF和RANKL誘導的骨髓來源單個核細胞向破骨細胞分化，降低TRAP酶活性，說明女貞子多糖可能通過調節鈣磷代謝和抑制破骨細胞分化發揮抗骨質疏松作用。但女貞子多糖是如何影響鈣磷代謝尚不明確，是否影響腸鈣磷吸收、促進骨組織中鈣沉積或降低尿鈣排泄，需要進一步實驗研究。綜上所述，研究證實女貞子多糖能有效抑制去卵巢所致的骨密度降低，其可能與調節骨代謝平衡和鈣磷代謝有關。本研究為女貞子多糖應用于絕經后骨質疏松癥治療提供理論依據。