EGF-ERK1∕2-IL-8通路在膽道閉鎖患兒Kasai術后膽管炎中的作用機制研究

鄭啟鵬，李夢迪，張聰，陳靈芝，趙一霖，楊芳，劉更新，詹江華

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是新生兒期梗阻性黃疸的常見原因，病變可累及肝內外膽管。如未接受治療，該病進展迅速，1歲以內病死率達90%，2歲以內病死率達100%［1］。一旦確診BA，需要行肝門空腸吻合術（Kasai術），但是Kasai術后仍有部分患兒最終需要接受肝移植。膽管炎是Kasai術后最常見的并發癥，多發生于術后1年內［2］，是影響自肝生存情況的重要因素［3］。有效地預防和治療膽管炎對于改善BA預后至關重要。本團隊前期研究發現，BA患兒肝組織CD4+和CD8+T細胞浸潤與Kasai術后膽管炎關系密切［4-5］，說明機體免疫炎癥狀態是影響Kasai術后膽管炎發生的重要因素。白細胞介素8（IL-8）主要由CD4+T細胞亞群Th1細胞分泌。有研究表明術前血清IL-8高表達提示Kasai術后預后較差［6］。在此基礎上，本文通過體內外研究探討IL-8與BA術后膽管炎的關系及其上游調控路徑。

1 資料與方法

1.1體內研究

1.1.1研究對象 納入2019年1月—2020年6月于天津市兒童醫院就診的33例BA患兒（BA組）和6例膽道擴張患兒（膽道擴張組），另選取年齡匹配的體檢健康嬰幼兒36例為正常對照組。日齡分別為（62.52±23.79）d、（57.00±29.42）d、（60.56±28.01）d，男女例數分別為21∕12、4∕2、16∕20。本研究經天津市兒童醫院倫理委員會審查通過，倫理批準號：

KY2020-05。

1.1.2隨訪方法和膽管炎診斷標準 采取門診∕住院以及電話∕微信等方式進行隨訪。主要隨訪內容包括患兒的一般情況（身高、體質量、體溫等），血清生化指標［天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、總膽紅素（TB）、結合膽紅素（DB）］，血常規［白細胞計數（WBC）、血紅蛋白（HB）、血小板計數（PLT）］，C反應蛋白等。患兒出現以下2項（至少1項A和1項B）即可診斷為膽管炎：大便顏色變淺或再次變為陶土色（A1）、黃疸加重或退而復現（A2）、血清TB或DB升高（A3）、炎癥指標（白細胞、C反應蛋白等）升高（B1）、除外其他部位感染引起的發熱（B2）［7-9］。根據術后6個月內是否有膽管炎發作，將33例BA患兒分為膽管炎組（18例）和無膽管炎組（15例）。

1.1.3血清和肝組織樣本獲取 獲取BA組和正常對照組血液樣本，其中BA組于術前采集，正常對照組于體檢時采集。取血后2 h，以3 500 r∕min離心5 min獲取上清液，置于-80℃超低溫冰箱內凍存，用于后續實驗。取6例BA組和膽道擴張組肝組織，制備病理切片，用于免疫組織化學染色。

1.1.4酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清IL-8和表皮生長因子（EGF）表達 將ELISA試劑盒室溫平衡20 min，取出所需板條；設置空白孔、標準液孔、樣本孔，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行實驗操作，最后測定各孔450 nm波長處光密度（OD）值，繪制標準曲線并計算每孔樣品EGF、IL-8濃度。ELISA試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司。

1.1.5免疫組織化學染色檢測磷酸化胞外信號調節激酶（p-ERK）1∕2表達 BA組和膽道擴張組肝組織病理切片經過脫蠟、抗原修復、封閉等過程后，加入p-ERK1∕2一抗（1∶250稀釋）于4℃孵育過夜、二抗工作液室溫孵育30 min、DAB顯色、蘇木精染核，滴加中性樹脂蓋玻片封片。

1.2體外研究

1.2.1主要試劑 RNA提取試劑盒（R6812-02）購自Omega公司，逆轉錄試劑盒（B532435）購自生工生物工程有限公司，RPMI 1640培養 基（SH30809.01）、DMEM高糖培養 基（SH30022.01B）購自hyclone公司，兔源p44∕42 MAPK（ERK1∕2）抗 體（4695S）、Phospho-p44∕42 MAPK（p-ERK1∕2）（Thr202∕Tyr204）抗體（4376S）購自Cell Signaling Technology公司，鼠源β-actin（A01010）一抗購自abbkine公司，HRP山羊抗鼠IgG（AS003）、HRP山羊抗兔IgG（AS014）購自ABclonal公司，重組人EGF蛋白（bs-2050P）購自北京博奧森公司，KO-947（HY-112181）購自MCE公司。定量聚合酶鏈反應（qPCR）引物購自生工生物工程有限公司，GAPDH引物上游5′-TTGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′，下 游5′-GACTCCACGACGTACTCAGC-3′；IL-8引物上游5′-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3′，下游5′-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3′。

1.2.2細胞系 人肝內膽管上皮細胞HIBEpic（BNCC，339778）、人正常肝細胞L-02（BNCC，351907）培養于RPMI 1640培養基，人肝星狀細胞LX-2（BNCC，341818）培養于DMEM高糖培養基，培養條件均為89%培養基、10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗，37℃恒溫，5%CO2。

1.2.3細胞分組干預（1）將L-02細胞分為4組，分別給予磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和25、50、100μg∕L EGF干預24 h，檢測IL-8水平。（2）將HIBEpic、L-02、LX-2細胞各分2組，分別給予PBS和100μg∕L EGF干預24 h，檢測IL-8水平。（3）將L-02細胞分為3組，給予100μg∕L EGF分別干預0、30、60 min，檢測ERK1∕2通路激活情況。（4）將L-02分為4組，分別給予PBS、EGF（100μg∕L）、KO-947（5 mmol∕L）、EGF（100μg∕L）+KO-947（5 mmol∕L）干預30 min，檢測ERK1∕2通路激活情況；同樣分組干預24 h，qPCR檢測IL-8 mRNA表達水平。

1.2.4Western blot檢測ERK1∕2通路蛋白表達 提取細胞總蛋白，以每孔8μL的上樣量進行SDS-PAGE電泳，濕轉法轉膜（250 mA恒流1.5 h），牛奶室溫封閉2 h，孵育一抗ERK1∕2（1∶1 000）、p-ERK1∕2（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）過夜，洗膜后室溫孵育二抗（1∶5 000）2 h，采用ECL化學發光法顯色。

1.2.5qPCR檢測IL-8 mRNA表達 采用Omega RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用酶標儀檢測總RNA濃度，取500 ng RNA逆轉錄成cDNA。cDNA稀釋10倍，進行qPCR檢測。反應體系：SYBR 5μL，模板1μL，上、下游引物各0.5μL，ddH2O 3μL。反應條件：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，循環35次。目的基因相對表達量=2-ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參。

1.3統計學方法 分別采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.3.1軟件進行統計學分析和繪圖，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；不符合正態分布的計量資料以中位數和四分位數［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；分類資料2組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膽管炎組和無膽管炎組患兒術前臨床指標比較 膽管炎組和無膽管炎組患兒性別、術時日齡，術前各項臨床指標比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組血清IL-8水平比較 BA組血清IL-8水平高于正常對照組，膽管炎組血清IL-8水平高于無膽管炎組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.3 血清EGF水平及與IL-8水平的相關性 BA組血清EGF水平顯著高于正常對照組。BA組血清EGF水平與IL-8水平呈正相關（rs=0.422，P＜0.01），見圖2。

2.4 p-ERK1∕2免疫組化染色結果 BA組肝組織中大量表達p-ERK1∕2，以匯管區膽管上皮細胞和肝細胞為主，而膽道擴張組肝組織內肝細胞和膽管上皮細胞未見p-ERK1∕2表達，見圖3。

Tab.1 Comparison of preoperative indicators between BA children with and without cholangitis表1 有無膽管炎組BA患兒術前指標對比

Fig.1 Comparison of serum IL-8 levels between the two groups圖1 各組血清IL-8表達水平比較

Fig.2 Serum EGF level and correlation analysis of serum EGF and IL-8圖2 血清EGF水平及其與IL-8表達水平的相關性

Fig.3 Immunohistochemical staining results of p-ERK1∕2 in children with BA and biliary dilatation圖3 BA及膽道擴張患兒p-ERK1∕2免疫組化染色結果

2.5 EGF對3種肝細胞IL-8表達水平的影響 25、50、100μg∕L的EGF干預L-02細胞后，與PBS干預相比，IL-8表達水平明顯升高，且具有濃度依賴性，其中100μg∕L EGF的誘導作用最為明顯，見圖4。3種肝細胞經100μg∕L EGF處理后，HIBEpic、LX-2細胞IL-8表達水平差異無統計學意義，L-02細胞IL-8表達升高，見圖5。

2.6 EGF誘導L-02細胞高表達IL-8依賴ERK1∕2蛋白磷酸化 100μg∕L的EGF干預L-02細胞后，p-ERK1∕2表達水平在30 min時開始出現明顯升高，見圖6。而ERK1∕2通路抑制劑KO-947干預后，p-ERK1∕2表達水平較EGF組顯著下降，見圖7。在此基礎上，采用EGF（100μg∕L）和KO-947（5 mmol∕L）單獨干預和聯合干預L-02細胞后發現，與單獨EGF相比，EGF聯合KO-947處理后L-02細胞IL-8 mRNA表達水平明顯下降，見圖8。

Fig.4 Influence of EGF on IL-8 expression in L-02 cells圖4 EGF對L-02細胞IL-8表達的影響

Fig.5 Influence of EGF on IL-8 expression in HIBEpic，LX-2 and L-02 cells圖5 EGF對HIBEpic、LX-2、L-02細胞IL-8表達的影響

Fig.6 Western blot analysis of t-ERK1∕2 and p-ERK1∕2 in L-02 cells after EGF(100μg∕L)intervention 0，30，60 min and semiquantitative analysis圖6 Western blot檢測EGF（100μg∕L）干預L-02細胞0、30、60 min后p-ERK1∕2表達水平及半定量分析

Fig.7 Western blot analysis of t-ERK1∕2 and p-ERK1∕2 in L-02 cells after EGF(100μg∕L)and∕or KO-947(5 mmol∕L)intervention and semiquantitative analysis圖7 Western blot檢測EGF（100μg∕L）和（或）KO-947（5 mmol∕L）干預L-02細胞后p-ERK1∕2表達水平及半定量分析

Fig.8 Changes of IL-8 mRNA level in L-02 cells after EGF(100μg∕L)and∕or KO-947(5 mmol∕L)intervention圖8 EGF（100μg∕L）和（或）KO-947（5 mmol∕L）干預L-02細胞后IL-8 mRNA水平變化

3 討論

膽管炎是影響Kasai術后自體肝生存的重要因素，尤其是術后短期內反復發生的難治性膽管炎［10］。目前膽管炎的發生機制尚未完全明確，可能是由機體內外因素共同作用導致，臨床上缺乏統一的預防和治療方案。盡管Kasai術中采取各種防反流措施，術后采取抗生素、激素等多種藥物長期聯合治療，但是膽管炎發生率仍然居高不下。因此，探索膽管炎的發生機制，尋找有效的預防和治療方法對改善Kasai術后預后至關重要。

IL-8屬于趨化因子家族成員之一，其生物學特性是吸引和激活中性粒細胞，在多種免疫性疾病中起重要作用。本研究發現，BA患兒術前血清IL-8水平明顯高于正常嬰幼兒，說明BA患兒術前即存在一定程度的免疫異常，此結果與El-Faramawy等［11］的研究結果相吻合。除此之外，Arafa等［12］發現BA患兒肝組織內IL-8表達陽性的炎性細胞數量顯著升高，且與肝纖維化程度呈正相關。結合上述研究可以發現，BA患兒肝組織和血清中均存在IL-8高表達，血清中高濃度的IL-8可能反映了肝組織免疫異常，IL-8介導的免疫炎癥反應可能在BA中起重要作用。

通過隨訪，本研究33例BA中有18例于術后6個月內出現膽管炎，其發生比例為54.4%，與文獻報道基本一致［8，13］。亞組分析顯示，2組患兒的術前生化、血常規等檢查結果無明顯差異，而Kasai術前血清IL-8水平與術后膽管炎間存在密切關系，術前高水平的IL-8預示著術后出現膽管炎的概率升高，術前血清IL-8水平可能作為預測膽管炎發生的指標之一。IL-8升高一定程度上反映機體的免疫異常狀態，即使手術解除了膽道梗阻，這種異常的免疫狀態可能仍會持續，在內外多種因素的作用下，更容易造成肝組織內膽管細胞的炎性損傷，導致膽汁引流障礙，進而發生膽管炎。Bessho等［14］研究發現，敲除IL-8的BA小鼠，其肝纖維化程度顯著減輕、生存情況顯著改善，說明IL-8可能是BA治療的潛在靶點。結合本研究的結果，筆者推測IL-8可能通過影響膽管炎的發生而影響Kasai術后自肝生存情況，術前IL-8水平可預測術后是否發生的膽管炎，而針對術前血清IL-8高表達的BA患兒加強抗炎治療可能是一種潛在的治療策略。為了探索IL-8過表達的分子機制，本研究基于上述結果進一步探索了IL-8上游調控通路。

本團隊在前期研究基礎上擴大樣本量檢測了BA患兒血清EGF水平，發現其與血清IL-8存在顯著正相關，提示兩者可能存在相互調控關系。Zhang等［15］研究發現，在肺癌細胞中，EGF可作為上游信號分子與其受體結合，激活細胞內信號通路，引起下游IL-8表達增多。為探索BA中是否也存在上述調控關系，本研究通過體外細胞培養，首先驗證了人EGF重組蛋白可誘導肝細胞L-02過表達IL-8，而這種誘導作用在肝星狀細胞LX-2和膽管上皮細胞HIBEpic中并未觀察到，說明肝細胞是BA患兒中IL-8過表達的主要參與細胞。本研究進一步證實EGF可激活L-02細胞中ERK1∕2信號通路，經KO-947抑制ERK1∕2磷酸化后可顯著抑制EGF對IL-8表達的促進作用，說明EGF在肝細胞中通過激活ERK1∕2信號通路后在基因水平誘導IL-8表達增多。為驗證ERK1∕2在BA肝組織中的激活情況，本研究通過p-ERK1∕2免疫組化發現，與膽總管囊腫肝組織比較，BA肝組織中存在大量高表達p-ERK1∕2蛋白的肝細胞。上述研究結果可以解釋IL-8在BA中的上游調控途徑，同時也為闡明BA術后膽管炎的發生機制提供了理論依據，可在此基礎上進行后續更深入的研究，探索預防和治療Kasai術后膽管炎的可能靶點。

綜上，本研究發現，BA患兒術前血清中IL-8表達顯著升高，與Kasai術后膽管炎關系密切，EGF可通過ERK1∕2信號通路促進肝細胞IL-8表達升高。