miR-34a靶向調控Akt∕Bcl-2對乳腺癌細胞多柔比星耐藥性的影響

吳金枝，馬虎，曹云亮，張川骎，茍小霞

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的主要原因之一［1］。化療作為乳腺癌最主要的治療手段之一，彌補了手術及放療等局部治療的不足，在乳腺癌的綜合治療中起著極其重要的作用。但是，由于臨床上部分患者對化療不敏感，即產生原發或繼發耐藥現象，導致化療失敗，患者生存期縮短，生存率降低［2-3］。化療耐藥是影響療效的主要因素，研究證實蛋白激酶B（Akt）信號通路的活化在腫瘤細胞耐藥產生過程中發揮重要作用。在化療藥物刺激下，腫瘤細胞可能通過高表達Akt來對抗凋亡［4］，增強細胞對化療藥物的耐藥性。微小RNA（miR）是近年來引起廣泛關注的一類小分子RNA，通過與靶基因3′非編碼區（UTR）結合參與基因轉錄后調控［5］。研究發現miR-34a與Akt基因UTR區存在結合位點，提示miR-34a可能通過調控Akt的表達水平參與細胞耐藥性的產生［6］。本研究擬在誘導多柔比星（DOX）耐藥乳腺癌細胞基礎上檢測miR-34a表達水平對細胞DOX耐藥性的影響，并驗證miR-34a通過調控Akt∕Bcl-2通路對細胞凋亡和DOX耐藥性的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細胞株MCF-7及人乳腺癌DOX耐藥細胞株MCF-7∕ADR均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胎牛血清和DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；0.25%胰酶、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miR-34a過表達類似物（miR-34a mimics）、過表達陰性對照物（NC mimics）、miR-34a干擾劑（miR-34a inhibitor）和干擾陰性對照物（NC inhibitor）由生物工程有限公司合成；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自Med Chem Express公司；Annexin V-FITC∕PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自美國Ambion公司；兔抗人Bcl-2購自Abcam公司，兔抗人Bax購自Santa Cruz公司，兔抗人Akt、p-Akt以及鼠抗人GAPDH均購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記的羊抗兔∕鼠二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；注射用鹽酸多柔比星購自山西普德藥業。Flexstation?3酶標儀購自美國Molecular Devices公司；QuantStudio 6型PCR儀購自美國ABI公司；cytoFLEX型流式細胞儀購自美國Beckman coulter公司。

1.2細胞培養及轉染 人乳腺癌細胞株MCF-7及DOX耐藥細胞株MCF-7∕ADR在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基的培養瓶中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞的密度達到80%時，對細胞進行傳代。細胞轉染時，將MCF-7及MCF-7∕ADR細胞以每孔1×105個接種于6孔板中。待細胞密度達到50%～60%時，更換為無血清培養基培養2 h。按照Lipofectamine 2000操作說明進行細胞轉染：MCF-7細胞分別轉染干擾陰性對照物（NC inhibitor組）及干擾劑（miR-34a inhibitor組）；MCF-7∕ADR細胞分別轉染過表達陰性對照物（NC mimics組）及過表達類似物（miR-34a mimics組）。轉染6 h后換液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，正常培養48 h后用于后續檢測實驗。

1.3qPCR法檢測miR-34a的表達 細胞轉染后使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，根據說明書逆轉錄后再進行定量PCR反應。引物序列見表1。反應體系為20μL，包括cDNA 4μL，上下游引物各0.4μL，SYBR Green Master Mix 10μL，ROX Dye 0.4μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理H2O 4.8μL。反應條件：95℃10 min，（95℃15 s，60℃60 s）40個循環，95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。以U6為參照，2-ΔΔCt法計算miR-34a相對表達水平，實驗重復3次。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.4CCK-8法檢測DOX處理細胞的半數有效抑制濃度（IC50）取處于對數生長期生長狀態良好的MCF-7和MCF-7∕ADR細胞，以5×103個∕孔接種于96孔板，設置空白組（僅加培養基）、對照組（不加DOX）和實驗組，每組各設置5個復孔。37℃、5%CO2培養箱中培養過夜后，實驗組中MCF-7細胞加入0、0.078、0.156、0.313、0.626、1.25、2.5、5 mg∕L的DOX進行處理，MCF-7∕ADR細胞加入0.1、0.3、1、3、10、30、100 mg∕L的DOX進行處理。培養24 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃反應4 h后于酶標儀測定各孔450 nm處的光密度（OD）值。細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）∕（對照組OD值-空白組OD值）×100%。繪制折線圖，采用非線性回歸的方法擬合細胞生存曲線，IC50即為乳腺癌細胞存活率降低一半時的藥物濃度。

1.5CCK-8法檢測miR-34a對細胞增殖能力的影響 轉染后各組細胞以5×103個∕孔接種于96孔板內，每組設置5個復孔，并使用IC50濃度的DOX進行處理。37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后，每孔加入10μL CCK8溶液。37℃反應4 h后，根據CCK-8試劑盒說明書檢測各組細胞存活率。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集轉染后的細胞，使用IC50值的DOX處理24 h后，用預冷的PBS洗2次，按照Annexin V-FITC∕PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明分別加入5μmol∕L的AnnexinV-APC，5μL 7-AAD至各組細胞，室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.7預測miR-34a與Akt的結合位點 利用ENCORI（http:∕∕starbase.sysu.edu.cn∕index.php）RNA結合靶點預測網站預測miR-34a與Akt的結合靶點，評定兩者是否存在理論上的結合位點及其具體位置。

1.8Western blot檢測Akt、Bcl-2及Bax蛋白的表達 轉染后的細胞用預冷的PBS清洗1遍后，RIPA裂解細胞并提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。各組取等量的蛋白30μg進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉印。37℃，5%BSA封閉1 h后 加 入1∶1 000稀 釋 的 一 抗Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax及GAPDH，4℃孵育過夜。次日使用TBST漂洗3次后，加入1∶3 000稀釋的羊抗兔∕鼠二抗，室溫孵育2 h后TBST漂洗3次。ECL顯色，Image Pro Plus軟件分析印跡條帶的灰度值并統計。

1.9統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Fig.1 Screening of IC50 values of MCF-7 and MCF-7∕ADR cells treated with doxorubicin圖1 DOX處理MCF-7和MCF-7∕ADR細胞IC50值篩選

2.1 miR-34a在細胞中的表達水平 qPCR結果顯示，與MCF-7細胞株相比，MCF-7∕ADR細胞株中miR-34a的基礎表達水平降低（1.005±0.128vs.0.282±0.007，n=3，t=9.756，P＜0.01）。與NC inhibitor組相比，miR-34a inhibitor組中miR-34a表達水平降低（1.003±0.092vs.0.309±0.001，n=3，t=13.112，P＜0.01）。與NC mimics組相比，miR-34a mimics組中miR-34a表達水平升高（1.004±0.110vs.300.186±33.383，n=3，t=15.523，P＜0.01）。

2.2 DOX處理MCF-7和MCF-7∕ADR細胞的IC50值 CCK-8結果顯示，DOX均呈劑量依賴性地抑制MCF-7和MCF-7∕ADR細胞生長，見圖1。DOX處理MCF-7及MCF-7∕ADR細胞的IC50值分別為0.895 mg∕L（95%CI：0.696～1.152）、13.607 mg∕L（95%CI：10.284～18.022），后續實驗采用該IC50值處理細胞。

2.3 miR-34a的表達對DOX耐藥性的調控 CCK-8結果顯示，經DOX處理后miR-34a inhibitor組MCF-7細胞存活率較NC inhibitor組升高［（104.674±2.052）%vs.（100.000±0.000）%，n=3，t=3.954，P＜0.05］。miR-34a mimics組MCF-7∕ADR細胞存活率較NC mimics組降低［（59.173±1.468）%vs.（90.229±1.417）%，n=3，t=26.359，P＜0.01］。

2.4 miR-34a表達對DOX誘導的細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示經DOX處理后miR-34a inhibitor組中MCF-7細胞凋亡率較NC inhibitor組降低［（2.767±0.153）%vs.（4.267±0.058）%，n=3，t=15.910，P＜0.01］。miR-34a mimics組中MCF-7∕ADR細胞凋亡率較NC mimics組升高［（25.867±1.234）%vs.（3.567±0.321）%，n=3，t=30.284，P＜0.01］。見圖2。

Fig.2 The effect of miR-34a on doxorubicin induced apoptosis圖2 miR-34a對DOX誘導的細胞凋亡的影響

2.5 miR-34a表達對Akt∕Bcl-2∕Bax通路的影響 通過miRNA靶點預測網站比對顯示，miR-34a與Akt基因3′UTR可能存在結合位點，見圖3。Western blot結果顯示，經IC50濃度的DOX處理后，miR-34a inhibitor組MCF-7細胞中p-Akt∕Akt和Bcl-2∕Bax較NC inhibitor組升高，miR-34a mimics組MCF-7∕ADR細胞中p-Akt∕Akt和Bcl-2∕Bax較NC mimics組降低，見圖4，表2、3。

Fig.3 Binding sites of miR-34a and Akt圖3 miR-34a與Akt結合位點

Fig.4 Effect of miR-34a expression level on the expression of Akt∕Bcl-2∕Bax protein圖4 miR-34a表達水平對Akt∕Bcl-2∕Bax蛋白表達的影響

Tab.2 Comparison of p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax protein levels of MCF-7 cells between the NC inhibitor group and the miR-34a inhibitor group表2 NC inhibitor組和miR-34a inhibitor組MCF-7細胞p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax protein levels of MCF-7 cells between the NC inhibitor group and the miR-34a inhibitor group表2 NC inhibitor組和miR-34a inhibitor組MCF-7細胞p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別NC inhibitor組miR-34a inhibitor組t p-Akt∕Akt 0.649±0.082 1.095±0.144 4.636＊Bcl-2∕Bax 0.803±0.020 2.182±0.108 21.650＊＊

Tab.3 Comparison of p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax protein levels of MCF-7/ADR cells between the NC mimics group and the miR-34a mimics group表3 NC mimics組和miR-34a mimics組MCF-7/ADR細胞p-Akt/Akt及Bcl-2/Bax比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax protein levels of MCF-7/ADR cells between the NC mimics group and the miR-34a mimics group表3 NC mimics組和miR-34a mimics組MCF-7/ADR細胞p-Akt/Akt及Bcl-2/Bax比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別NC mimics組miR-34a mimics組t p-Akt∕Akt 0.703±0.095 0.461±0.048 3.921＊Bcl-2∕Bax 0.646±0.008 0.193±0.012 51.212＊＊

3 討論

DOX作為目前乳腺癌臨床治療中最常用的一種化療藥物，在術前、術后輔助以及解救性化療中占有重要的位置。然而，多藥耐藥的發生往往會逐漸影響DOX的療效［7］。miRNA是一大類長約22個核苷酸的內源性保守的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因結合而調控細胞內重要的信號通路的表達水平［8］。研究證實，miRNAs在維持腫瘤細胞惡性表型和耐藥調控中起重要作用［9］。藥物干擾腫瘤細胞內miRNA的表達譜后，也相應地增加了腫瘤細胞對傳統化療藥物的敏感性［10］，提示通過干擾乳腺癌細胞中特異性的miRNA表達，能夠為克服腫瘤耐藥開辟新的治療途徑。

隨著首個基于模擬靶向miR-34a的藥物MRX34Ⅰ期臨床試驗的開展，miR-34對腫瘤細胞功能的調控作用越來越受到重視［11］。一些研究發現miR-34a在多種腫瘤組織中異常表達［12-13］，并通過靶向p53等重要信號通路參與上皮-間充質轉化的調控［14］。在結腸癌中miR-34a通過抑制E2F轉錄因子3和組蛋白去乙酰化酶抑制結腸癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性［10］。本研究中，與乳腺癌細胞株MCF-7相比，miR-34a的表達水平在DOX耐藥細胞株MCF-7∕ADR中顯著降低。CCK-8實驗示DOX對MCF-7及MCF-7∕ADR的IC50分別為0.895 mg∕L和13.607 mg∕L，而經IC50水平的DOX處理后，miR-34a inhibitor組中細胞存活率較NC inhibitor組顯著升高。miR-34a mimics組中細胞存活率較NC mimics組顯著降低，證明miR-34a在乳腺癌DOX的耐藥形成中發揮重要作用，miR-34a的表達水平降低能顯著增強乳腺癌細胞對DOX的耐藥性。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是區別于細胞壞死的另一種細胞死亡方式［15］。耐藥蛋白能夠通過調控癌細胞凋亡水平達到抗腫瘤的效果。Eid等［16］發現類胡蘿卜素巖藻黃質可通過誘導細胞凋亡、抑制多藥耐藥蛋白等途徑增強腫瘤細胞對DOX的敏感性。Sun等［17］研究發現纖維蛋白原相關蛋白1通過調節ADP核糖聚合酶1（PARP1）∕半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）3通路，使非小細胞肺癌細胞系PC9∕GR對吉非替尼產生耐藥。本研究檢測MCF-7及MCF-7∕ADR細胞凋亡水平的變化，結果顯示經DOX處理后，miR-34a inhibitor組中細胞凋亡率較NC inhibitor組顯著減少，而miR-34a mimics組中凋亡細胞率較NC mimics組顯著升高，表明miR-34a通過調控細胞凋亡參與乳腺癌細胞耐藥的形成，miR-34a表達降低通過抑制細胞凋亡增強DOX耐藥性。

此外，本研究通過ENCORI預測miR-34a調控的靶分子為Akt，并通過免疫印跡法進行了驗證，結果發現miR-34a mimics組較NC mimics組細胞p-Akt∕Akt和Bcl-2∕Bax水平降低，而miR-34a inhibitor組較NC inhibitor組細胞p-Akt∕Akt和Bcl-2∕Bax水平升高，表明miR-34a在乳腺癌細胞中，通過靶向Akt 3′UTR負向調控Akt的表達及其蛋白磷酸化，進而增強促凋亡蛋白Bax表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，最終促進凋亡的發生。這一機制在抑制乳腺癌細胞耐藥形成中發揮了重要的作用。該結果與目前主流觀點一致。研究發現在多種腫瘤細胞中PI3K∕Akt通路表達異常，并參與了耐藥形成，如索拉非尼［18］和柔紅霉素［19］耐藥形成中，靶向調控PI3K∕Akt通路則能顯著改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

綜上，本研究發現miR-34a的表達在乳腺癌DOX耐藥細胞株MCF-7∕ADR中顯著下調。miR-34a的下調促進Akt∕Bcl-2信號通路的活化，增強細胞抗凋亡能力，最終增強細胞對DOX的耐藥性。靶向上調miR-34a的表達，能夠顯著降低MCF-7∕ADR的耐藥性，進而發揮潛在治療作用。本研究結果為探討miR-34a與Akt在乳腺癌耐藥中的相互作用的研究奠定了基礎。由于單個miRNA可以有多個靶基因且1個靶基因可以受到多種miRNA的調控，因而不排除miR-34a可作用于其他靶基因，協同Akt∕Bcl-2通路影響乳腺癌細胞對DOX敏感性的可能，故尚需進一步探索。