LINC01123通過miR-449a調控HGF∕c-MET通路參與宮頸癌發生發展的分子機制

杜晨旭，公建莊，張藝，張適，燕巍，謝林森△

宮頸癌（cervical carcinoma，CC）是一種嚴重的女性惡性腫瘤。世界衛生組織的數據顯示，2020年CC全球新發病例超過60萬，死亡病例超過34萬，我國CC發病率也呈逐年增高趨勢，且發病人群逐漸年輕化［1-2］。由于CC的異質性和腫瘤細胞易轉移的特征，患者在治療后易發生耐藥或腫瘤轉移，導致預后不良［3］。因此，探索CC的發病機制及尋找可能的治療靶標具有重要意義。異常表達的長鏈非編碼RNA（lncRNA）存在于CC病變的不同階段，為探索CC的發病機制及尋找CC新型腫瘤標志物提供了方向［4］。LINC01123是一種與癌癥相關的lncRNA，在非小細胞肺癌［5］、結腸癌［6］、子宮內膜癌［7］等多種癌癥中表達水平上調。研究者在基因表達譜數據動態分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA）數據庫中發現，LINC01123在CC中的表達明顯高于正常組織；starBase數據庫預測顯示，lncRNA LINC01123和MicroRNA-449a（miR-449a）之間存在結合位點，而miR-449a在CC中呈低表達，為CC的預后標志物［8］。目前，有關CC中LINC01123表達情況的研究鮮見。本研究旨在探討LINC01123的表達對CC惡性生物學行為的影響及其可否通過調節miR-449a而參與CC的進展，并分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人宮頸癌細胞系SiHa、HeLa、CaSki均購自上海酶研生物科技有限公司，貨號分別為CC-Y1460、CCY1211、CC-Y1086；人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic購自上海細胞庫-ATCC細胞庫，貨號：BFN60806593。

1.2主要試劑與儀器 胎牛血清、DMEM培養基及胰蛋白酶購自美國Gbico公司；Lipofectamine 3000轉染試劑購自Sigma-Aldrich；LINC01123過表達載體質粒（pcDNA3.1-LINC01123）及其陰性對照空載體質粒（pcDNA3.1-NC）、LINC01123 siRNA（si-LINC01123）及其陰性對照（si-NC）、miR-449a mimic及其 陰 性 對照（mimic-NC）、miR-449a inhibitor及其陰性對照（inhibitor-NC）以及實時熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）引物均由上海GenePharma合成；TRIzol試劑、PrimeScript RT逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自碧云天生物科技公司；人工重構基底膜膠（Matrigel）購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning公司，貨號3413；兔源一抗肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、細胞間質上皮轉化因子（c-MET）、磷酸化c-MET（p-c-MET）、β-actin，二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）均購自英國abcam公司。細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統（美國應用生物系統公司）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；iMark680多功能酶標儀、FACSCantoⅡ流式細胞儀、蛋白轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）。

1.3生物信息學分析 在GEPIA數據庫（http:∕∕gepia.cancerpku.cn∕index.html）中分析CC組織中差異表達的lncRNA。在starBase v2.0數據庫（http:∕∕starbase.sysu.edu.cn∕index.php）中預測LINC01123的靶miRNA。

1.4細胞實驗

1.4.1細胞培養 將人CC細胞SiHa、HeLa、CaSki和人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic在含10%胎牛血清、100 U∕mL青霉素和100 mg∕L鏈霉素的DMEM培養基中于37℃、5%CO2培養箱中培養。每2 d換液1次，3～4 d傳代1次，待細胞處于對數生長期進行后續實驗。

1.4.2qPCR檢測細胞中LINC01123、miR-449a的表達水平 用TRIzol試劑從CC細胞和正常子宮頸上皮細胞中分離RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板進行qPCR擴增，反應體系體積為25μL：SYBR預混合溶液12.5μL、上下游引物各1μL、cDNA模板2μL和ddH2O 8.5μL。反應條件：94℃預變性5 min；95℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸7 min，40個循環。以GAPDH或U6為內參，2-ΔΔCt計算目的基因相對表達水平。引物序列見表1。

1.4.3細胞分組和轉染 取對數生長期的CaSki細胞，以2×106個∕孔的密度接種于24孔板，培養24 h待細胞達到90%融合時，進行轉染，分成7組：對照組（NC組，不進行任何轉染）、pcDNA3.1-NC組（將LINC01123過表達載體質粒陰性對照pcDNA3.1-NC轉染至CaSki細胞）、LINC01123過表達組（將LINC01123過表達載體質粒pcDNA3.1-LINC01123轉染至CaSki細胞）、si-NC組（將si-LINC01123陰性對照si-NC轉染至CaSki細胞）、LINC01123沉默組（將si-LINC01123轉染至CaSki細胞）、LINC01123沉默+inhibitor-NC組（將si-LINC01123和miR-449a inhibitor陰性對照inhibitor-NC共轉染至CaSki細胞）、LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組（將si-LINC01123和miR-449a inhibitor共轉染至CaSki細胞），轉染按照Lipofectamine 3000試劑說明書進行。轉染后將細胞在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養。48 h后，收集各組細胞，qPCR檢測轉染效果，步驟同1.4.2；轉染成功后，用于后續實驗。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.4.4CCK-8法檢測細胞增殖活性 轉染48 h后，將各組細胞用胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，取100μL細胞懸液（每孔5×103個細胞）接種于96孔板中。培養48 h后加入CCK-8溶液（10μL∕孔），于37℃、5%CO2條件下孵育1 h，在酶標儀上于450 nm處測量光密度（OD）值，評估細胞活力。

1.4.5流式細胞術分析細胞凋亡 使用碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒鑒定凋亡細胞。轉染48 h后，收集各組細胞，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，并重懸于1×結合緩沖液中；將細胞用5μL Annexin V-FITC染色15 min，然后在室溫下避光用5μL PI染色10 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

可以看出, 兩種情況下附面層速度分布基本一致, 18°葉片在12°葉片結果的基礎上使附面層厚度進一步降低了1.5 mm. 圖5給出兩種安裝角度下尾渦誘導速度ω分布曲線.

1.4.6劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 取各組CaSki細胞，胰蛋白酶消化后，以5×104個∕孔的密度接種于24孔板中，置37℃培養箱中培養。待細胞完全貼壁后，用200μL移液器吸頭在每個孔內劃一道痕，置于培養箱中繼續培養，倒置顯微鏡下（×100）在同一位置于0 h和48 h拍照，觀察劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率（%）=（48 h劃痕寬度∕0 h劃痕寬度）×100%

1.4.7Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 將各組CaSki細胞（每孔5×104個）用胰蛋白酶消化并用無血清培養基接種至Transwell上室中（含有Matrigel膠）。下室裝有800μL含10%胎牛血清的DMEM培養基。37℃培養48 h后，用冷甲醇固定20 min，0.1%結晶紫溶液染色。染色后，使用濕棉簽仔細擦去殘留在上室底部表面的細胞。對小室底部發現的遷移細胞進行拍照并計數。每組隨機讀取3個視野，計數穿膜細胞數平均值表示細胞侵襲能力。

1.4.8Western blot檢測細胞HGF∕c-MET通路相關蛋白的表達 將各組細胞與RIPA裂解緩沖液混合，在冰上裂解30 min后，于4℃下以14 000×g離心10 min，收集細胞裂解液，使用BCA法定量測定蛋白質濃度，90℃變性5 min。取蛋白質樣品（30μg）于10%SDS-PAGE凝膠電泳。然后將其轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉30 min，兔抗HGF、c-MET、p-c-MET、β-actin（均1∶500）4℃孵育過夜，用含有0.1%Tween-20的Tris緩沖液（TBST）洗滌后，與山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。通過化學發光試劑盒（ECL）檢測增強的蛋白質條帶。以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.4.9雙熒光素酶報告基因檢測 應用starBase v2.0數據庫分析預測LINC01123和miR-449a之間存在的結合位點。設計克隆了野生型LINC01123（LINC01123-WT）序列，包含miR-449a的結合位點，并將其插入熒光素酶載體質粒pmirGLO中。同時構建突變型序列LINC01123-MUT。將Caski細胞以2×105個∕孔的密度接種在6孔板中，分為miR-NC+LINC01123-MUT組、miR-NC+LINC01123-WT組、miR-449a mimic+LINC01123-MUT組、miR-449a mimic+LINC01123-WT組，待細胞達到80%～90%融合時，分別將LINC01123-WT和LINC01123-MUT與miR-449a mimic或mimic-NC共轉染至CaSki細胞。轉染48 h后，收集細胞，使用雙重熒光素酶報告基因測定系統檢測熒光素酶活性。

1.5統計學方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析。所有實驗均重復3次。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Fig.1 The expression of LINC01123 in CC tissues圖1 LINC01123在CC組織中的表達

2.1 LINC01123在CC組織和細胞中的表達情況及靶miRNA篩選 GEPIA數據庫分析結果顯示，LINC01123在CC組織中的表達水平高于正常組織（P＜0.05），見圖1。qPCR檢測結果也顯示，人CaSki、SiHa、HeLa細胞中LINC01123的表達水平高于人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic（P＜0.05），而miR-449a在人CC細胞中呈低表達（P＜0.05）；CC細胞株中CaSki細胞LINC01123的表達量相對較高，故用于后續實驗，見表2。

Tab.2 Comparison of the expression levels of LINC01123 and miR-449a between different types of human CC cells表2 不同種類人CC細胞中LINC01123、miR-449a表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of LINC01123 and miR-449a between different types of human CC cells表2 不同種類人CC細胞中LINC01123、miR-449a表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與HcerEpic細胞比較，b與CaSki細胞比較，P＜0.05。

細胞HcerEpic CaSki SiHa HeLa F LINC01123 1.00±0.00 2.86±0.29a 2.19±0.24ab 1.75±0.21ab 39.358＊＊miR-449a 1.00±0.00 0.32±0.04a 0.54±0.06ab 0.71±0.08ab 85.129＊＊

2.2 各組CaSki細胞中LINC01123、miR-449a的表達 與NC組比較，pcDNA3.1-NC組和si-NC組LINC01123、miR-449a的表達差異無統計學意義（P＞0.05），LINC01123過表達組LINC01123的表達水平升高，而miR-449a的表達水平降低（P＜0.05），LINC01123沉默組細胞中LINC01123的表達水平降低，而miR-449a的表達水平升高（P＜0.05）；與LINC01123沉默組比較，LINC01123沉默+inhibitor-NC組細胞中LINC01123、miR-449a的表達差異無統計學意義（P＞0.05），LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組細胞中miR-449a的表達水平降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of the expression levels of LINC01123 and miR-449a between the seven groups of CaSki cells表3 各組CaSki細胞中LINC01123、miR-449a表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of the expression levels of LINC01123 and miR-449a between the seven groups of CaSki cells表3 各組CaSki細胞中LINC01123、miR-449a表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LINC01123沉默組比較，P＜0.05；其他組間不需要比較，未標注；表4～6同。

組別NC組pcDNA3.1-NC組LINC01123過表達組si-NC組LINC01123沉默組LINC01123沉默+inhibitor-NC組LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組F LINC01123 1.00±0.00 1.01±0.10 3.24±0.35a 1.03±0.08 0.26±0.03a 0.29±0.03a 0.27±0.04a 162.377＊＊miR-449a 1.00±0.00 1.03±0.11 0.21±0.03a 1.01±0.09 2.46±0.27a 2.39±0.24a 1.37±0.15b 79.492＊＊

Fig.2 Apoptosis rate of CaSki cells in each group(flow cytometry)圖2 各組CaSki細胞凋亡率（流式細胞術）

2.4 各組CaSki細胞的遷移、侵襲能力比較 與NC組比較，pcDNA3.1-NC組和si-NC組細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05），LINC01123過表達組細胞明顯向劃痕區域遷移，劃痕愈合率、侵襲細胞數量顯著增加（P＜0.05），LINC01123沉默組細胞向劃痕區域的遷移程度明顯受到抑制，劃痕愈合率、侵襲細胞數量降低（P＜0.05）；與LINC01123沉默組比較，LINC01123沉默+inhibitor-NC組細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05），LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數量顯著增加（P＜0.05），見表5，圖3、4。

Tab.4 Comparison of the proliferation activity and apoptosis rate of CaSki cells between the seven groups表4 各組CaSki細胞的增殖活性與凋亡率比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of the proliferation activity and apoptosis rate of CaSki cells between the seven groups表4 各組CaSki細胞的增殖活性與凋亡率比較（n=3，±s）

組別NC組pcDNA3.1-NC組LINC01123過表達組si-NC組LINC01123沉默組LINC01123沉默+inhibitor-NC組LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組F增殖活性（OD值）0.62±0.07 0.64±0.08 0.97±0.10a 0.61±0.06 0.42±0.05a 0.39±0.04a 0.62±0.06b 23.104＊＊細胞凋亡率（%）10.21±1.13 9.95±1.06 4.36±0.54a 10.07±1.02 18.24±1.93a 17.91±1.85a 11.46±1.29b 39.954＊＊

Tab.5 Comparison of the migration and invasion ability of CaSki cells in each group表5 各組CaSki細胞的遷移、侵襲能力比較（n=3，±s）

Tab.5 Comparison of the migration and invasion ability of CaSki cells in each group表5 各組CaSki細胞的遷移、侵襲能力比較（n=3，±s）

組別NC組pcDNA3.1-NC組LINC01123過表達組si-NC組LINC01123沉默組LINC01123沉默+inhibitor-NC組LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組F劃痕愈合率（%）47.04±5.42 43.68±4.91 82.17±8.94a 46.59±5.13 30.42±3.56a 31.20±3.39a 45.16±4.68b 30.153＊＊侵襲細胞數量（個）127.59±13.24 132.21±15.06 218.73±24.15a 130.66±14.48 81.52±12.34a 85.96±10.17 124.39±13.54b 26.119＊＊

2.5 各組CaSki細胞中HGF∕c-MET通路相關蛋白的表達水平比較 與NC組比較，pcDNA3.1-NC組和si-NC組細胞中HGF的表達和p-c-MET∕c-MET比值差異無統計學意義（P＞0.05），LINC01123過表達組細胞中HGF的表達和p-c-MET∕c-MET比值顯著增加（P＜0.05），LINC01123沉默組細胞中HGF的表達和p-c-MET∕c-MET比值降低（P＜0.05）；與LINC01123沉默組比較，LINC01123沉默+inhibitor-NC組細胞中HGF的表達和p-c-MET∕c-MET比值差異無統計學意義（P＞0.05），LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組細胞中HGF的表達和pc-MET∕c-MET比 值 顯 著 增 加（P＜0.05），見 圖5、表6。

Fig.3 The migration ability of CaSki cells in each group(×100)圖3 各組CaSki細胞的遷移能力（×100）

Fig.4 The invasion ability of CaSki cells in each group(Crystal violet staining，×200)圖4 各組CaSki細胞的侵襲能力（結晶紫染色，×200）

Fig.5 The expression of HGF∕c-MET pathway related proteins in CaSki cells of each group圖5 各組CaSki細胞中HGF∕c-MET通路相關蛋白的表達

Tab.6 Comparison of the expression of HGF/c-MET pathway related proteins between the seven groups of CaSki cells表6 各組CaSki細胞中HGF/c-MET通路相關蛋白的表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.6 Comparison of the expression of HGF/c-MET pathway related proteins between the seven groups of CaSki cells表6 各組CaSki細胞中HGF/c-MET通路相關蛋白的表達水平比較 （n=3，±s）

組別NC組pcDNA3.1-NC組LINC01123過表達組si-NC組LINC01123沉默組LINC01123沉默+inhibitor-NC組LINC01123沉默+miR-449a抑制劑組F HGF 0.68±0.07 0.67±0.09 1.32±0.15a 0.65±0.08 0.30±0.05a 0.33±0.04a 0.61±0.07b 46.530＊＊p-c-MET∕c-MET 0.34±0.04 0.36±0.05 0.77±0.08a 0.33±0.04 0.15±0.03a 0.17±0.03a 0.29±0.05b 53.945＊＊

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測結果 應用starBase v2.0數據庫預測發現，LINC01123包含miR-449a的結合序列，見圖6。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與miR-NC+LINC01123-WT組比較，miR-449a mimic+LINC01123-WT組LINC01123-WT細胞熒光素酶活性降低（1.00±0.00vs.0.46±0.07；n=3，t=13.362，P＜0.05），miR-NC+LINC01123-MUT組與miR-449a mimic+LINC01123-MUT組比較差異無統計 學 意 義（1.02±0.11vs.0.98±0.12；n=3，t=0.426，P＞0.05）。

Fig.6 Target gene prediction圖6 靶基因預測

3 討論

近年來，lncRNA在CC中的作用越來越受到重視，lncRNA可作為原癌基因或抗癌基因，與癌癥的發生關系密切。LINC01123是一種具有促癌作用的重要lncRNA，在各種癌癥中呈高表達，與腫瘤的大小和轉移關系密切［9］。研究顯示，LINC01123的低表達不僅影響腫瘤形成，而且可抑制非小細胞肺癌［5］、結腸癌［6］、子宮內膜癌［7］等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究發現，LINC01123在CC組織和細胞系中的表達水平上調，過表達LINC01123組細胞增殖活性、遷移與侵襲能力均較NC組升高，細胞凋亡率降低，而在沉默LINC01123的細胞中，CaSki細胞的增殖、遷移與侵襲能力均降低，細胞凋亡率升高，表明LINC01123可影響CC細胞的生長和轉移，提示LINC01123在CC的發展中起著重要的調節作用。

lncRNA可充當miRNA海綿或與miRNA競爭性結合mRNA，在轉錄、轉錄后和表觀遺傳水平上調節基因表達，從而影響包括CC在內的腫瘤進展［7］。研究顯示，lncRNA PTENP1通過與miR-106b競爭性結合來抑制CC的進展［10］；lncRNA DANCR通過與miR-335-5p競爭性結合來上調Rho關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coilbinding protein kinase 1，ROCK1）的表達，促進CC的進展［11］。本研究中通過starBase v2.0數據庫預測發現，LINC01123包含miR-449a的結合序列；而miR-449a已被鑒定為多種癌癥中的腫瘤抑制基因。Wang等［8，12］發現，miR-449a在CC中呈低表達，影響腫瘤的進展，并與腫瘤耐藥性有關，上調其表達水平可抑制CC腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。lncRNA FAL1可通過下調miR-449a，從而促進SOX上調，導致宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）細胞的遷移和侵襲［13］。本研究結果顯示，在沉默LINC01123表達的基礎上，將miR-449a inhibitor轉染CaSki細胞以下調miR-449a的表達后，CaSki細胞的增殖、遷移與侵襲能力均增加，細胞凋亡率降低，表明沉默LINC01123對CaSki細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用被減弱，而熒光素酶報告基因檢測再次證實，LINC01123可靶向調節miR-449a的表達，提示miR-449a是LINC01123的靶基因，LINC01123的過表達可能通過靶向下調miR-449a的表達，從而促進CC細胞的生長和轉移。

c-MET是位于染色體7q21-q31上的MET原癌基因編碼的受體酪氨酸激酶，在許多器官的上皮細胞中均有表達。已知c-MET的唯一配體是HGF。HGF主要由間充質來源的細胞分泌，以旁分泌方式作用于表達c-MET受體的上皮細胞，可誘導c-MET二聚化，從而激活其自身磷酸化，c-MET磷酸化后，可作為多功能對接位點招募細胞內效應蛋白，進行信號傳導［14］。在許多類型的癌癥中，常見HGF∕c-MET通路失調，c-MET的激活、過度表達或基因畸變與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移有關，c-Met已被公認為包括CC在內的靶向腫瘤轉移的治療靶點［15］。研究顯示，在CC病變中HGF、c-MET過表達與患者較差的預后有關［16］。抑制HGF誘導的c-MET磷酸化可抑制c-MET下游信號傳導，進而可抑制CC的進展［17］。c-MET為miR-449a的直接靶標，在肝癌中，miR-449a的過表達可通過靶向抑制c-MET，從而抑制肝癌細胞的生長［18-19］。基于此，筆者推測miR-449a可能通過靶向調節c-MET的表達，從而參與CC的進展過程，研究結果亦顯示，在LINC01123過表達的CaSki細胞中，miR-449a的表達水平降低，而HGF和p-c-MET∕c-MET比值均增加，但是在下調LINC01123表達后，HGF和p-c-MET∕c-MET比值均降低，并且在沉默LINC01123的基礎上將miR-449a inhibitor轉染CaSki細胞下調miR-449a表達后，HGF和p-c-MET∕c-MET比值升高，表明在CC中，miR-449a可靶向調節c-MET的表達，提示LINC01123可能通過miR-449a調控HGF∕c-MET通路，從而參與CC的發生和發展。

綜上所述，LINC01123在CC組織和細胞中呈高表達，沉默LINC01123可能通過上調miR-449a，抑制HGF∕c-MET信號通路的活化，進而抑制CC細胞的生長和轉移。然而，本研究僅從細胞水平上初步探究了LINC01123在CC進展中的作用及相關機制，但機體是一個復雜的整體，體內與體外環境有明顯差異，因此在體內能否發揮相同的作用還有待進一步研究。