非諾貝特改善脂多糖誘導的急性肺損傷及其機制研究

董超，李華宇，區豪杰，孫嘉，張陸勇，劉冰△

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）∕急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是以過度炎癥反應和氧化應激為主要特征的疾病［1-3］。臨床上ALI患者的病死率接近33%［4］，主要的呼吸支持療法也會引起呼吸機相關肺炎等并發癥［5-6］，抗生素等藥物治療ALI整體有效率不高［7］。因此，亟需尋找有效且不良反應小的藥物干預ALI的發生和發展。非諾貝特（fenofibrate，Fen）在臨床上主要用于降血脂和抗動脈粥樣硬化，還能延緩糖尿病視網膜病變［8］，改善非酒精性脂肪性肝炎［9］，其安全性已得到廣泛認可。實驗研究發現其還能改善博萊霉素誘導的大鼠纖維化以及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠氣道炎癥［10-11］。然而，Fen對于ALI的作用仍未知。本研究擬采用LPS誘導細胞和ALI小鼠模型，探討Fen的作用及機制，為臨床上治療ALI提供潛在的候選藥物。

1 材料與方法

1.1材料 肺泡基底上皮細胞A549細胞株購自中國科學院上海細胞庫，C57BL∕6雄性小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2019-0004，6～8周齡。

1.2主要試劑 c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、B淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）及Bcl-2相 關X蛋 白（bcl-2-associated X，Bax）抗體購自Abclonal；二抗山羊抗兔IgG（CST）；LPS、2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、H2O2購自Sigma；Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）雙染凋亡試劑盒購自貝博生物公司；瑞氏-吉姆薩復合染色液購自雷根生物；鼠源腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6和IL-1β高靈敏酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自聯科生物；RIPA裂解液購自碧云天；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自Gibco；PierceTMBCA Protein Assay Kit購自Thermo scientific；JNK激動劑Anisomycin（Ani）購自MCE。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑購自索萊寶科技有限公司。

1.3體內實驗

1.3.1動物分組與造模 30只C57BL∕6雄性小鼠采用隨機數字表法分成6組，即正常組，模型組（LPS組），陽性藥地塞米松（DXMS）組及Fen低、中、高劑量組，每組5只。小鼠造模前禁食、禁水12 h。正常組小鼠通過氣管插管給予250μL PBS，其余組小鼠相同操作給予1 g∕L LPS造模，劑量10 mg∕kg，給藥量不足250μL的用PBS補足。造模6 h后，DXMS組腹腔注射50μg∕kg DXMS。Fen低、中、高劑量組分別腹腔注射Fen 20、40和80 mg∕kg。

1.3.2取材 分組處理12 h后，0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉后打開胸腔，暴露肺部，分離出主氣管，用注射器針頭扎一小口，將給藥插管順著小口插入氣管內，并用手術縫合線打結固定。用注射器抽取0.5 mL PBS，通過氣管插管注射入肺部，可觀察到肺部充盈，打入回抽2～3次，回收液體即為肺泡灌洗液（BALF）。BALF收集結束后脫頸處死小鼠，獲取肺組織。左肺用于HE染色；右肺上葉用于組織勻漿，中葉用于測量肺濕∕干質量比，下葉用于后續Western blot實驗。

1.3.3小鼠肺組織濕∕干質量比檢測 用濾紙將右肺中葉組織表面血液和水分吸干，稱質量，記錄為濕質量（wet weight，W）。然后將肺組織置于70℃烘箱內，烘烤48 h，再次稱質量，記錄為干質量（dry weight，D）。計算肺組織濕∕干質量比，判斷肺部水腫情況。

1.3.4小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量檢測 取約10 mg右肺上葉組織加入90μL的RIPA裂解液，用研磨機充分研磨制成10%的肺組織勻漿，研磨結束后12 000 r∕min，離心30 min，吸取上清液。采用雙抗體夾心ELISA測定TNF-α、IL-6、IL-1β水平，嚴格按照試劑盒步驟操作，根據吸光度值分別計算含量。

1.3.5小鼠BALF中總蛋白含量及中性粒細胞和巨噬細胞數目測定 取0.1 mL BALF，3 000 r∕min離心5 min，上清液按照BCA試劑盒步驟嚴格操作，計算樣本總蛋白含量。下層細胞用0.5 mL PBS重懸制成細胞懸液，利用細胞計數板進行總細胞數計數。再取50μL細胞懸液滴于載玻片上，用一個蓋玻片作為推片，放在液滴前方，緩慢后移，使液滴在載玻片上均勻鋪展。室溫自然干燥后，用瑞氏-吉薩姆染液染色，低倍鏡下找到合適的視野，計數200個細胞，再根據巨噬細胞和中性粒細胞的形態學特征以及顏色差別，分類計數巨噬細胞數和中性粒細胞數。

1.3.6HE染色 取出已固定于4%多聚甲醛24 h的肺組織，流水沖洗，乙醇梯度脫水，經透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片、撈片、烘片、脫蠟后進行HE染色。在50倍和200倍光鏡下觀察各組肺組織病理學改變。評分標準按照（1）肺間質水腫；（2）肺泡水腫；（3）炎性細胞浸潤；（4）肺泡出血；（5）肺泡結構完整性破壞以上5項中的無、輕、中、重程度分別計為0、1、2、3分，計算平均分為肺組織的病理損傷評分。

1.4體外實驗

1.4.1細胞培養 將凍存的A549細胞取出復蘇，吸取凍存管中的液體至已含10 mL培養基的離心管中，1 000 r∕min離心2 min。離心結束后，將細胞用4 mL含10%胎牛血清的1640培養基充分混懸并轉移至培養瓶中，置于溫度37℃，體積分數5%的CO2培養箱中進行培養。實驗1設Control組、LPS（10 mg∕L）組、LPS+Fen（5μmol∕L）組、LPS+Fen（10μmol∕L）組、LPS+Fen（20μmol∕L）組。實驗2設Control組、LPS（10 mg∕L）組、LPS+Fen（20μmol∕L）+H2O2（100μmol∕L）組。

1.4.2細胞活性氧（ROS）水平檢測 將A549細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后按照1.4.1分組給予藥物處理12 h，Control組不用藥物處理，用無血清的1640培養基培養12 h。處理后用25μmol∕L的DCFH-DA在37℃條件下避光孵育30 min。用流式細胞儀在激發波長488 nm、發射波長525 nm處檢測ROS水平。

1.4.3細胞凋亡水平檢測 將A549細胞接種于60 mm培養皿中，待細胞貼壁后按照1.4.1分組給予藥物處理12 h，Control組不用藥物處理，用不含血清的1640培養基培養12 h。給藥結束后，收集細胞，PBS重懸2次，加入Annexin V結合緩沖液并用5μL Annexin V-FITC孵育15 min。最后加入10μL PI避光孵育5 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.4.4Western blot 將A549細胞接種于60 mm培養皿中，待細胞貼壁后按照1.4.1分組給予藥物處理12 h，Control組不用藥物處理，用不含血清的1640培養基培養12 h，另設LPS+Fen 20μmol∕L+Ani組，給予LPS（10 mg∕L）+Fen（20μmol∕L）+JNK激動劑Ani（3μmol∕L）。給藥結束后，收集細胞制備樣品。檢測各組細胞樣品和各肺組織樣品（正常組、模型組及Fen低、中、高劑量組）中p-JNK、JNK、Bcl-2及Bax含量。采用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。取50μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電泳：恒壓80 V，20 min，分離膠電泳：恒壓120 V，60 min。恒流330 mA轉膜30 min后，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h。內參β-Tubulin、p-JNK、JNK、Bax及Bcl-2一抗（均1∶1 000稀釋）分別在4℃下孵育過夜，山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000稀釋）孵育1 h。最后加入發光液后利用凝膠成像儀進行曝光拍照，Image J 1.47v統計灰度值計算相對表達量。

1.5統計學方法 實驗均重復3次，所得計量資料數據以均數±標準差（±s）表示；應用GraphPad Prism 7.01軟件進行數據分析，2組間計量資料進行t檢驗，多組間計量資料采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體內實驗

2.1.1 Fen可明顯改善ALI小鼠肺損傷 與正常組相比，模型組小鼠肺組織濕∕干質量比增大（P＜0.05），HE染色可見肺泡間隔變厚，肺泡結構破壞嚴重，肺組織損傷評分升高（P＜0.05）。與模型組相比，DXMS組及Fen低、中、高劑量組小鼠肺組織濕∕干質量比減小，肺組織損傷評分下降（P＜0.05），肺組織病理損傷情況有所改善；尤其DXMS組及Fen高劑量組可見肺泡間隔清晰，大部分肺泡結構較為完整，見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of wet-dry ratio of lung tissue and pathological injury score between the six groups表1 各組小鼠肺組織濕/干質量比及肺組織病理損傷評分比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與Fen低劑量組比較，d與Fen中劑量組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組Fen低劑量組Fen中劑量組Fen高劑量組DXMS組F肺組織濕∕干質量比4.83±0.23 7.10±0.20a 6.17±0.15ab 5.79±0.11ab 5.53±0.18abc 5.17±0.34bcd 69.880＊＊損傷評分（分）0.56±0.23 2.80±0.22a 2.08±0.32ab 1.72±0.16ab 1.20±0.25abc 0.84±0.29bcd 43.470＊＊

2.1.2 Fen可明顯改善ALI小鼠炎癥反應 與正常組相比，模型組小鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-6及IL-1β水平上升（P＜0.05）；BALF中總蛋白含量上升，巨噬細胞及中性粒細胞數量增多（P＜0.05）。與模型組相比，DXMS和Fen低、中、高劑量組治療后，小鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-6及IL-1β水平下降，BALF中總蛋白含量下降（P＜0.05）；DXMS和Fen中、高劑量組巨噬細胞及中性粒細胞數量減少（P＜0.05），見表2、3。

2.1.3 Fen可抑制ALI小鼠肺組織JNK活性和細胞凋亡 與正常組相比，模型組小鼠肺組織p-JNK和Bax表達明顯增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少（P＜0.05）。與模型組相比，Fen各劑量干預組能夠抑制ALI小鼠肺組織JNK的磷酸化并伴隨促凋亡蛋白Bax表達明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增高（P＜0.05），見圖2。

Fig.1 HE staining of lung tissues of mice in each group圖1 各組別小鼠肺組織HE染色切片

Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-1β levels and total protein［BALF］in lung tissues of mice between the six groups表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β及總蛋白［BALF］水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-1β levels and total protein［BALF］in lung tissues of mice between the six groups表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β及總蛋白［BALF］水平比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與Fen低劑量組比較，d與Fen中劑量組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組Fen低劑量組Fen中劑量組Fen高劑量組DXMS組F TNF-α（ng∕L）248.10±9.78 629.84±27.55a 560.92±15.08ab 463.63±19.13abc 385.25±19.79abcd 293.37±13.38abcde 332.900＊＊IL-6（ng∕L）274.31±109.11 2 637.60±364.51a 1 737.81±178.80ab 1 361.63±223.37ab 844.23±144.19abcd 695.68±150.91abcd 79.920＊＊組別正常組模型組Fen低劑量組Fen中劑量組Fen高劑量組DXMS組F IL-1β（ng∕L）78.64±10.76 164.77±4.89a 125.52±4.43ab 108.53±5.44abc 67.32±7.10bcd 135.90±5.86abde 145.700＊＊總蛋白［BALF］（g∕L）236.16±37.78 670.46±30.66a 579.04±29.18ab 519.40±38.23ab 442.15±39.52abc 357.02±62.33abcde 72.690＊＊

Tab.3 Comparison of the number of total cells，macrophages and neutrophils in BALF between the six groups of mice表3 各組小鼠BALF中總細胞、巨噬細胞和中性粒細胞數目比較 （n=5，±s）

Tab.3 Comparison of the number of total cells，macrophages and neutrophils in BALF between the six groups of mice表3 各組小鼠BALF中總細胞、巨噬細胞和中性粒細胞數目比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與Fen低劑量組比較，d與Fen中劑量組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組Fen低劑量組Fen中劑量組Fen高劑量組DXMS組F總細胞數（×105∕mL）3.88±0.23 13.46±0.45a 12.78±0.47a 10.22±0.66abc 8.20±0.78abcd 5.72±0.41abcde 260.000＊＊巨噬細胞數90.2±7.3 117.0±5.6a 110.6±3.4a 96.8±6.4bc 94.4±6.3bc 97.6±6.1bc 15.050＊＊中性粒細胞數20.0±4.1 62.4±4.6a 60.2±4.6a 40.6±5.3abc 32.0±4.1abc 27.6±4.3bcd 74.710＊＊

2.2 體外實驗

2.2.1 Fen抑制LPS誘導的ROS水平升高 流式細胞術結果顯示，與Control組相比，LPS組A549細胞ROS水平顯著升高；與LPS組相比，LPS+Fen 5μmol∕L組、LPS+Fen 10μmol∕L組及LPS+Fen 20μmol∕L組ROS水平明顯下降（P＜0.05），見圖3。

2.2.2 Fen抑制LPS誘導的A549細胞凋亡 流式細胞術的結果顯示，與Control組相比，LPS組A549細胞凋亡率顯著升高；與LPS組相比，LPS+Fen 5μmol∕L組、LPS+Fen 10μmol∕L組以及LPS+Fen 20μmol∕L組均可抑制LPS誘導的細胞凋亡（P＜0.05），見圖4。

Fig.2 Expressionlevelsofp-JNK，JNK，Bcl-2andBaxproteinsin lungtissuesofdifferentgroupsofmice圖2 各組小鼠肺組織中p-JNK、JNK、Bcl-2和Bax蛋白表達情況

Fig.3 Changes of ROS levels in different groups of A549 cells圖3 各組A549細胞中ROS水平的變化

Fig.4 Changes of apoptosis rate in different groups A549 cells圖4 各組A549細胞中凋亡率變化

2.2.3 H2O2逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞ROS生成的影響 與LPS+Fen 20μmol∕L組相比，LPS+Fen+H2O2組ROS水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。Fen能夠減少LPS誘導的ROS生成，加入H2O2后，Fen的這種作用效果被逆轉。

2.2.4 H2O2逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞凋亡的影響 與LPS+Fen 20μmol∕L組相比，LPS+Fen+H2O2組凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖6。

2.2.5 Fen抑制LPS誘導的A549細胞JNK活化和凋亡 Western blot結果顯示，Fen能夠抑制A549細胞JNK的磷酸化，同時促凋亡蛋白Bax表達顯著減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著增多（P＜0.05），見圖7。

2.2.6 H2O2逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞JNK活化和凋亡的影響 Western blot結果顯示，加入H2O2后，p-JNK和促凋亡蛋白Bax的表達顯著增多并伴隨抗凋亡蛋白Bcl-2表達的顯著減少，Fen對p-JNK、Bcl-2和Bax蛋白的作用被明顯抑制（P＜0.05），見圖8。

Fig.5 Effects of Fen on LPS-induced ROS levels after adding H2O2 in A549 cells圖5 H2O2逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞ROS水平的影響

2.2.7 Fen通過ROS∕JNK信號通路抑制LPS誘導的A549細胞凋亡 加入Ani后，與LPS+Fen 20μmol∕L組比較，LPS+Fen 20μmol∕L+Ani組促凋亡蛋白Bax的表達顯著增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減少，Fen對ROS∕JNK信號通路的影響被JNK激動劑Ani所逆轉，見圖9。

Fig.6 Effects of Fen on LPS-induced A549 cell apoptosis after adding H2O2圖6 H2O2逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞凋亡的影響

3 討論

全新藥物的研發投資大，耗時長，成功率低［12］，而已上市藥物的藥物動力學以及安全性資料較為詳盡，新適應證的開發能較快進入臨床評估，大大縮減研發成本和周期。因此，“老藥新用”越來越受到關注。Fen是臨床上經典的降血脂藥物，近年來已有大量文獻報道其可用于改善糖尿病視網膜病變、精神分裂癥、急性腎損傷和肝損傷等疾病［13-15］。本研究發現，Fen能顯著改善LPS誘導的ALI小鼠模型的肺組織病理損傷，降低肺組織的濕∕干質量比，證明Fen可減輕ALI，可成為臨床上治療ALI的有效候選藥物。此外，本實驗進一步發現，Fen能顯著減少小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的分泌，降低中性粒細胞和巨噬細胞的數量，表明Fen能抑制LPS誘導的肺部組織炎癥反應。Yeh等［13］報道，Fen可顯著抑制核因子（NF）-κB和炎性趨化因子如人單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、Fractalkine及細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達，延緩糖尿病視網膜病變。Nakano等［9］的研究也證實，Fen能夠抑制IL-1β、IL-6、IL-8及MCP-1等促炎因子mRNA的表達，進而減輕角膜損傷。以上結果提示，Fen可能是一個有效的廣譜抗炎藥，可用于多種炎癥相關疾病的治療。此外，與甾體類抗炎藥物DXMS相比，Fen具有良好的臨床安全性和耐受性［16］，提示Fen比DXMS更適合在臨床上治療ALI。

肺泡基底上皮細胞在內的多種細胞損傷會導致肺部屏障通透性增加，體液中的中性粒細胞和白細胞更易浸潤到肺部，從而誘發過度的炎癥反應［17］。研究顯示，肺部炎癥反應和氧化應激與ALI密切相關［18］。本研究發現，Fen能夠抑制LPS誘導的A549中ROS含量升高及細胞凋亡。進一步實驗結果顯示，加入H2O2后，Fen抑制凋亡的作用被逆轉。這表明Fen減輕ALI的機制可能是通過抑制ROS升高并減少細胞凋亡實現的。

JNK信號通路與LPS誘導的小鼠ALI進程中多形核粒細胞的聚集有關［19］，而ROS能夠調控JNK信號通路［20-22］。本研究中蛋白印跡結果顯示，Fen能夠抑制A549細胞JNK的磷酸化，同時伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達的顯著增多。進一步實驗發現，Fen引起的凋亡相關蛋白變化均能被JNK激動劑Ani所逆轉，表明Fen可通過抑制ROS∕JNK信號通路，繼而減少LPS誘導的細胞凋亡。在ALI小鼠肺組織中，JNK的磷酸化和凋亡相關蛋白的改變也與細胞實驗的結果相符。

Fig.7 Effects of different doses of Fen on p-JNK，JNK，Bcl-2 and Bax protein expression in LPS-induced A549 cells圖7 不同劑量Fen對LPS誘導的A549細胞p-JNK、JNK、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Fig.8 Effects of Fen on p-JNK，JNK，Bcl-2 and Bax protein expression levels in LPS-induced A549 cells after adding H2O2圖8 H2O2逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞p-JNK、JNK、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Fig.9 Effects of Fen on Bcl-2 and Bax protein expression in LPS-induced A549 cells after adding Ani圖9 Ani逆轉Fen對LPS誘導的A549細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

綜上所述，Fen能夠通過ROS∕JNK信號抑制凋亡來改善LPS誘導的小鼠ALI，可能成為臨床上治療ALI的候選藥物。