葉酸對IUGR大鼠胎盤VEGF及其受體1表達(dá)的影響

高琳琳，王軍，郭妍妍，劉曉梅△

葉酸作為一種水溶性維生素參與人體眾多的生化代謝過程，在產(chǎn)科實踐中廣泛用于預(yù)防新生兒先天畸形［1］。妊娠期因胚胎細(xì)胞的迅速增殖導(dǎo)致葉酸需求量增加，容易引起葉酸缺乏，而葉酸的缺乏會造成新生兒貧血、早產(chǎn)、先天畸形等。宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）是指胎兒體質(zhì)量低于同胎齡平均體質(zhì)量的第10百分位數(shù)［2］。IUGR不僅能引起圍生兒的死亡，還會增加其成年后發(fā)生心血管疾病、糖尿病等疾病的概率［3］。目前普遍認(rèn)為IUGR的發(fā)病機(jī)制是子宮胎盤發(fā)育不良，導(dǎo)致功能受損，限制了營養(yǎng)物質(zhì)向胎兒的輸送，造成胎兒生長減慢甚至停止［4］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族的成員及其受體1（vascular endothelial growth factor receptor-1，F(xiàn)lt1）是胎盤絨毛內(nèi)血管生長和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5］。IUGR的發(fā)生與孕婦胎盤中VEGF及Flt1表達(dá)下降密切相關(guān)［6］。因此，本研究通過建立IUGR孕鼠模型以觀察葉酸對IUGR孕鼠胎盤VEGF表達(dá)的影響，探討葉酸對IUGR胎鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級Wistar大鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（遼）2015-0001］，20只12周齡雌性處女鼠，體質(zhì)量210～230 g，4只12周齡雄性鼠，體質(zhì)量270～300 g；飼養(yǎng)于恒溫（22±2）℃、恒濕（60%～70%）的飼養(yǎng)室內(nèi)。實驗經(jīng)本院倫理協(xié)會審核并通過，倫理審批號：2018PS288K（X1），整個動物實驗期間嚴(yán)格遵循實驗動物3R原則。

1.1.2試劑與儀器 葉酸購自美國Sigma公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；熒光染料SYBR GreenⅠ購自日本Takara公司；RNA提取試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；RNA濃度測量儀Nano Vue分光光度計（GE公司，美國）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）擴(kuò)增儀（ABI7500 Fast，Thermo公司，美國）；VEGF多克隆抗體（貨號ab42802，Abcam公司，英國）；Flt1多克隆抗體（貨號13687-1-AP）和β-actin抗體（貨號66009-1-Ig，Proteintech公司，中國），山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗（中杉金橋公司，北京）。低蛋白飼料（蛋白質(zhì)含量為7%）購自北京華阜康［許可證號：SCXK（京）2014-008］。

1.2實驗分組及IUGR大鼠模型建立 于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)的20只12周齡的雌性處女鼠中隨機(jī)抽取10只，交配前2周給予葉酸，每日2.0 mg∕kg灌胃處理［7］，做好標(biāo)記，其余雌鼠不做處理，以雌雄比例為4∶1合籠過夜。次日清晨做陰道涂片，在顯微鏡下檢出精子則定為受孕第0天，分為4組，每組5只，即正常對照（N）組、IUGR組、葉酸+正常對照（A+N）組，葉酸+IURG（A+IUGR）組。N組于孕第0天給予正常飲食（蛋白質(zhì)約為23%），飲水正常。IUGR組于孕第0天給予低蛋白飲食，飲水正常［8］。A+N組和A+IUGR組為交配前2周給予葉酸處理的10只雌性鼠，受孕成功后于孕第0天A+N組給予正常飲食，A+IUGR組低蛋白飲食，并繼續(xù)給予葉酸，每日2.0 mg∕kg灌胃處理至取材當(dāng)天，飲水正常。取材：孕鼠在孕20 d時剖宮產(chǎn)取胎鼠及胎盤，稱胎鼠體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量并計算其胎盤系數(shù)（胎盤系數(shù)是胎盤質(zhì)量占胎鼠體質(zhì)量的比值）。各組分別從剖宮產(chǎn)取的22只胎盤中隨機(jī)抽取6個胎盤，用無菌紗布盡量吸干胎盤上的水分，一半胎盤組織放于4%多聚甲醛中固定，另一半胎盤組織于-80℃冰箱保存。

1.3免疫組化染色檢測胎盤VEGF和Flt1蛋白的表達(dá)情況 將胎盤組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，經(jīng)過無水乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，隨后包埋成蠟塊，48 h后切片（厚度3μm）。石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)（微波修復(fù)8 min）、封閉內(nèi)源性過氧化物酶（3%過氧化氫30 min）、封閉非特異性抗原∕電荷（5%血清30 min）后加一抗（VEGF 1∶200，F(xiàn)lt1 1∶250）4℃孵育過夜，次日加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育30 min，DAB（1∶50）顯色，蘇木素染核（2 min），以棕黃色為陽性標(biāo)記。利用NIS-Elements F3.0、NIS-Elements Br3.0及NiKon E800（Nikon，日本）對圖像進(jìn)行采集分析，參數(shù)設(shè)定一致，以保證圖像的可比較性。

1.4Western blot檢測胎盤VEGF和Flt1蛋白表達(dá)情況 取100 mg胎盤組織，每組6個標(biāo)本，加入蛋白裂解液，提取蛋白，用酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白濃度測定，然后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后分別加入抗體VEGF、Flt1、β-actin 4℃過夜，之后室溫孵育二抗2 h，顯色發(fā)光，用軟件Gelpro32分析VEGF、Flt1蛋白與β-actin的比值。

1.5qPCR檢測胎盤VEGF和Flt1mRNA表達(dá) 取20 mg胎盤組織，每組6個標(biāo)本，加入TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL；反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s。PCR引物見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，通過檢測解鏈曲線來驗證引物的特異性。40個循環(huán)后分析熔解曲線及Ct值，每個樣本重復(fù)3次取平均值。采用2-ΔΔCt法計算VEGF、Flt1經(jīng)內(nèi)參β-actin標(biāo)化后的相對表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)充葉酸對胎鼠、胎盤生理參數(shù)的影響 各組每只孕鼠的產(chǎn)仔量為8～14只。IUGR組胎鼠體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量和胎盤系數(shù)較N組明顯降低（P＜0.05）。A+IUGR組的體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量和胎盤系數(shù)高于IUGR組（P＜0.05），見表2。

2.2 各組VEGF和Flt1蛋白表達(dá)的比較 免疫組化結(jié)果顯示，VEGF、Flt1在各組胎盤均可見表達(dá)，IUGR組胎盤中VEGF、Flt1的表達(dá)明顯低于N組，與IUGR組相比，A+IUGR組胎盤中VEGF、Flt1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而A+IUGR組與N、A+N組相比無明顯差異，見圖1。Western blot結(jié)果顯示，VEGF、Flt1的蛋白表達(dá)水平在IUGR組較N組下調(diào)，A+IUGR組較IUGR組上調(diào)（P＜0.05），見圖2。

2.3VEGF和Flt1mRNA在各組胎鼠胎盤中表達(dá)量的變化 與N組比較，IUGR組胎盤中VEGF、Flt1mRNA表達(dá)明顯降低，A+IUGR組VEGF、Flt1mRNA表達(dá)較IUGR組顯著增加（P＜0.05），見圖3。

Tab.2 The body mass，placental mass and placental coefficient of fetal rats in the four groups表2 4組胎鼠體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量及胎盤系數(shù)的情況（n=22，±s）

Tab.2 The body mass，placental mass and placental coefficient of fetal rats in the four groups表2 4組胎鼠體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量及胎盤系數(shù)的情況（n=22，±s）

＊P＜0.05；a與N組比較，b與IUGR組比較，P＜0.05。

組別N組IUGR組A+IUGR組A+N組F體質(zhì)量（g）5.050±0.149 3.508±0.290a 3.704±0.441b 4.882±0.349 130.758＊胎盤質(zhì)量（g）0.455±0.083 0.339±0.027a 0.355±0.018b 0.397±0.034 25.998＊胎盤系數(shù)（%）0.099±0.016 0.064±0.009a 0.083±0.012b 0.107±0.019 38.090＊

3 討論

Fig.1 The expression of VEGF and Flt1 protein in the placenta of four groups of fetal rats detected by IHC(Immunohistochemistry staining，×400)圖1 IHC檢測VEGF、Flt1蛋白在4組胎鼠胎盤中表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

IUGR是妊娠期嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，在我國的發(fā)病率為8.77%，也是圍生期胎兒死亡的第2大原因，IUGR引起的胎兒的患病率和死亡率比正常發(fā)育胎兒高4～8倍［9］。胎盤是胚胎從母體獲得營養(yǎng)的主要器官。胎盤本身是一個代謝極為活躍的器官，消耗從母體循環(huán)中獲取的大部分氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)，在IUGR時，胎盤因素是最主要致病因素。胎盤的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)會直接影響胚胎的發(fā)育，當(dāng)胎盤輕度發(fā)育不良時，機(jī)體的代償機(jī)制會通過增加營養(yǎng)交換表面積來促進(jìn)胎盤血管生成以及降低胎盤厚度等來增加營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能；但當(dāng)胎盤發(fā)育嚴(yán)重不良時，胎盤代償功能將不能滿足胎兒進(jìn)一步生長發(fā)育的需求，從而導(dǎo)致IUGR。在IUGR子代胎盤中發(fā)現(xiàn)其血管生成及滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常的主要原因是子宮胎盤血流量和胎盤物質(zhì)交換面積減少［10］。研究表明，IUGR孕婦子宮胎盤血流量較正常孕婦降低超過50%，且IUGR胎盤中的絨毛血管密度、絨毛間隙體積、終末絨毛的數(shù)量、滋養(yǎng)細(xì)胞及滋養(yǎng)干細(xì)胞的分化均顯著降低［10］。

葉酸是水溶性B族維生素，作為一碳單位代謝過程中甲基的供體，參與體內(nèi)核酸合成、DNA甲基化、絲氨酸和甘氨酸相互轉(zhuǎn)化等重要生化代謝反應(yīng)，對維持胚胎發(fā)育進(jìn)程中胚胎細(xì)胞的分裂和增殖起著重要作用［11］。近年來有文獻(xiàn)報道，葉酸和胎兒發(fā)育關(guān)系密切［12］。對葉酸缺乏動物模型研究的結(jié)果也顯示，低葉酸飲食母鼠的懷孕率降低，孕鼠的孕期體質(zhì)量增加較緩，孕鼠宮內(nèi)活胎數(shù)減少，吸收胎、死胎比例增加，胎鼠質(zhì)量下降，大部分活胎的大體形態(tài)學(xué)顯示正常［13］。VEGF被稱為血管通透性因子，廣泛存在于胎盤組織中，是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要血管調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化、誘導(dǎo)血管生成、增加微血管通透性等多種功能［14-15］。VEGF是近年來發(fā)現(xiàn)的特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的高效促有絲分裂因子，在刺激新血管的產(chǎn)生與成長，維持血管壁的完整性和正常通透性方面均有重要意義，且妊娠后胎盤組織中VEGF的表達(dá)水平有明顯上升［16］。

Fig.2 The expression of VEGF and Flt1 protein in the placenta of four groups of fetal rats detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測VEGF、Flt1蛋白在4組胎鼠胎盤中表達(dá)情況

Fig.3 mRNA expressions of VEGF and Flt1 in the four groups圖3 4組中VEGF和Flt1 mRNA表達(dá)

為了探討葉酸對IUGR胎鼠發(fā)育的保護(hù)機(jī)制，筆者采用低蛋白飲食法構(gòu)建IUGR大鼠模型，在交配前2周進(jìn)行葉酸的灌胃處理，檢測IUGR組和A+IUGR組胎盤中VEGF和Flt1的表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示，IUGR組胎盤中VEGF的蛋白和mRNA表達(dá)水平與N組相比顯著下降。VEGF表達(dá)的下調(diào)可能會引起胎盤血管構(gòu)建的改變，從而影響胎盤的血液供應(yīng)，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩［17］。本研究還發(fā)現(xiàn)，A+IUGR組胎盤組織中VEGF、Flt1的表達(dá)較IUGR組顯著增加，說明葉酸可以增強(qiáng)VEGF和Flt1在IUGR組胎盤中的表達(dá)，從而促進(jìn)胎盤細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)胎盤的血管生成，通過增加胎盤血流量來保證胎鼠的營養(yǎng)輸送，最終緩解IUGR對胎鼠各器官的損傷，改善IUGR胎鼠的發(fā)育。葉酸可恢復(fù)高膽固醇血癥大鼠的毛細(xì)血管密度［18］。葉酸補(bǔ)充可促進(jìn)糖尿病大鼠受損的血管形態(tài)恢復(fù)，并增加胚胎卵黃囊中血管內(nèi)皮生長因子A的基因表達(dá)水平［19］。葉酸還可通過提高VEGF的DNA甲基化水平延緩動脈硬化病變的發(fā)展［20］。雖然胎盤血管生成可能受多種因素影響，但在IUGR組給與葉酸治療后VEGF和Flt1的同步升高，表明這2種基因可能是這一過程的主要調(diào)節(jié)因素。

綜上所述，葉酸可提高胎鼠胎盤內(nèi)VEGF和Flt1的表達(dá)水平，增加胎鼠的體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量，但有關(guān)葉酸對子代大鼠身體生長發(fā)育和成年后代謝的影響，有待進(jìn)一步研究。