山楂葉總黃酮對脊髓損傷后大鼠的作用研究*

韋入菲，黃潔瓊，寧 宇，馬瑞鑫，石卓華，曾高峰Δ

（廣西醫(yī)科大學 1.公共衛(wèi)生學院；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科；3.再生醫(yī)學與醫(yī)用生物資源開發(fā)應用協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021)

脊髓損傷（SCI）是一種發(fā)病率高且愈后不良的高致殘性疾病，多為猛烈的外力作用于脊柱所致，至今尚無法完全治愈，一旦患上將會給患者的身心健康及其家庭的經(jīng)濟水平造成巨大的負擔，此疾病的常規(guī)治療具有治療周期長、副作用大和治療費用高等缺點[1-3]。SCI 包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其中繼發(fā)性損傷包括缺血、水腫、炎癥和氧化細胞損傷等，是一系列復雜的病理生理過程[4]。繼發(fā)性損傷階段是人為干預SCI進展和阻止病灶進一步擴大的主要階段，而炎癥因子的浸潤是原發(fā)性病灶侵害周圍完好脊髓的重要條件[5]。

山楂葉總黃酮（TFHL）提取自山楂葉，是一種易于獲取的植物化學物和中藥，具有毒性低和副作用少的特點[6]。TFHL具有較為優(yōu)越的抗炎功能[7]，而在SCI早期炎癥的浸潤和進展是SCI加重的關鍵因素[4]，故本研究擬探索TFHL對SCI后的大鼠血液和脊髓中炎癥的作用及其對大鼠運動功能的影響。為未來的人群試驗和相關機制的研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

山楂葉總黃酮（山西康立生藥業(yè)有限公司，批號：15200401，純度≥95%）、ELISA 試劑盒（酶聯(lián)生物，上海）。

1.2 動物模型的建立與分組

40只（220±20）g的SD大鼠購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心動物（生產(chǎn)許可證號：SCXK GUI 2014-0002；動物使用許可證號：SYXK GUI 2014-0003)。所有飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境，動物飼養(yǎng)環(huán)境符合大鼠的作息節(jié)律且動物實驗獲得廣西醫(yī)科大學動物倫理審查委員會的批準。使用完全隨機抽樣法將大鼠平均分為假手術組、模型組及TFHL低劑量組（25 mg/kg）、TFHL 中劑量組（50 mg/kg）和TFHL 高劑量組（75 mg/kg）。使用改良Allen’s 打擊法構建SCI 模型[8]，麻醉大鼠后備皮，以T10 為中心切開約2 cm的手術切口后暴露脊髓，使10 g的克氏針從距脊髓 3 cm的高度自由落體，造成脊髓中度損傷，其中假手術組僅進行脊髓暴露，不打擊，形成假手術對照。然后用生理鹽水清洗傷口，依次縫合肌肉、筋膜和皮膚。術后3 d 內(nèi)每天予3 萬U 的青霉素鈉以預防感染。每天進行輔助排尿，直至大鼠恢復自主排尿。術后3 d，大鼠后肢無條件反射，生命體征平穩(wěn)則視為模型成功建立。

1.3 給藥方式

根據(jù)低、中、高劑量組依次配制濃度為10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL 的TFHL 溶液，溶劑為生理鹽水。按體重確定每只大鼠的給藥量，每天通過灌胃給藥一次，持續(xù)7 d。模型組和假手術組給予等量的生理鹽水作為對照。

1.4 體重記錄

使用體重秤稱量損傷前及損傷后第1、3、5 和7天的體重，計算每一只大鼠體重相較于損傷前的變化程度。

1.5 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分

按照BBB評分標準評估SCI后大鼠第1、3、5和7天的運動功能依次評判動物后肢各關節(jié)活動（0～7分），步態(tài)和協(xié)調(diào)功能（8～13分），運動時爪子的精細運動（14～21分）。由2名能掌握并熟悉運用BBB評分且不了解分組情況的實驗人員進行評分。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

SCI 后第8 天采集大鼠靜脈血至含EDTA 的抗凝管中，離心后收集血漿。使用ELISA試劑盒進行IL-4、IL-17A、IFN-γ和TNF-α等炎癥因子水平測定。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

大鼠SCI 后第8 天以損傷點為中心取下約1.5 cm 的脊髓，稱取50 mg 使用TRIZOL?法提取RNA 后進行逆轉(zhuǎn)錄，使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 進行RT-qPCR（StepOne Plus 7500，賽默飛世爾，美國），擴增條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min 循環(huán)40次。檢測IL-4、IL-17A、IFN-γ 和TNF-α 等炎癥因子相關基因的表達。本實驗所用引物均由Primer Premier 5 設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列（5’～3’）如下：IL-4上游：CAAGGAACACCACGGAGAACGAG，下游：CTTCAAGCACGGAGGTACATCACG、IL-17A：上游：AGTGTGTCCAAACGCCGAG，下游：GTCCAGGGTGAAGTGGAACG、IFN-γ：上游：GGCAAAAGGACGGTAACACG，下游：TCTGTGGGTTGTTCACCTCG、TNFα：上游：CCACGCTCTTCTGTCTACTG，下游：GCTACGGGCTTGTCACTC 和GAPDH：上游：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，下游：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA。

1.8 蘇木精—伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE staining）

損傷后第8天，麻醉大鼠后進行生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，取出以損傷點為中心的脊髓組織約1 cm，固定于4%的多聚甲醛，然后按標準流程制作石蠟切片（3 μm/組織面），進行HE 染色，使用顯微鏡（Axio Imager M2p）觀察組織形態(tài)。

1.9 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0 進行數(shù)據(jù)分析。計算均數(shù)和標準差，BBB評分和體重數(shù)據(jù)使用重復測量的方差分析，其他數(shù)據(jù)則使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TFHL緩解SCI后大鼠體質(zhì)量的減輕

SCI 后，與假手術組比較，模型組（P＜0.001）、TFHL低（P＜0.05）、中（P＜0.01）、高（P＜0.05）劑量組體重的減輕程度均顯著高于假手術組；經(jīng)TFHL治療，與模型組比較，TFHL 低（P＜0.01）、中（P＜0.05）、高（P＜0.01）劑量組體重的減輕程度較模型組低，但TFHL低、中、高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 SCI后大鼠體重變化情況

2.2 TFHL促進SCI后大鼠運動功能的恢復

SCI 后，與假手術組比較，模型組（P＜0.001）、TFHL 低（P＜0.001）、中（P＜0.001）、高（P＜0.001）劑量組的BBB評分均顯著低于假手術組，，經(jīng)TFHL治療，與模型組比較，TFHL 低（P＜0.05）、中（P＜0.05）、高（P＜0.01）劑量組的BBB 評分的增長較模型組的快，但不同劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。損傷后第5 天，TFHL 低（P＜0.05）、中（P＜0.05）、高（P＜0.05）劑量組的評分顯著高于第1 和3 天；損傷后第7 天，模型組、TFHL 低（P＜0.01）、中（P＜0.001）、高（P＜0.05）劑量組的評分顯著高于第5 天；且于損傷后第7 天，TFHL 低（P＜0.001）、中（P＜0.01）、高（P＜0.001）劑量組的評分顯著高于模型組（圖2）。

圖2 SCI后大鼠運動功能恢復情況

2.3 TFHL抑制SCI后血液中大鼠炎癥的產(chǎn)生

ELISA結(jié)果顯示，TFHL低劑量組的IFN-γ（P＜0.05），中劑量組的IL-17A（P＜0.05）和IFN-γ（P＜0.05）水平顯著降低，TFHL 中劑量組的IL-4 水平顯著升高（P＜0.01）；而各組的TNF-α 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 SCI后7 d炎癥因子的表達量

2.4 TFHL 抑制SCI 后脊髓中炎癥相關基因的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示，與模型組比較，TFHL低劑量組的IL-17A（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.001），TFHL 中劑量組的IL-17A（P＜0.001）、TNF-α（P＜0.01）和IFN-γ（P＜0.01）及TFHL 高劑量組的IL-17A（P＜0.01）和IFN-γ（P＜0.05）水平顯著降低（P＜0.05），TFHL 低劑量組的IL-4 水平顯著升高（P＜0.001）（圖4）。

圖4 SCI后7 d炎癥因子mRNA的相對表達量

2.5 TFHL改善SCI后脊髓組織的破壞和神經(jīng)元的狀態(tài)

假手術組脊髓結(jié)構完整，神經(jīng)元數(shù)量較多、排列規(guī)整且形態(tài)大小正常；模型組脊髓結(jié)構被破壞，灰質(zhì)內(nèi)空洞增加，神經(jīng)元萎縮減少，炎性細胞浸潤；與模型組比較，TFHL 低劑量組的脊髓結(jié)構更為完整，灰質(zhì)內(nèi)空洞的面積和面積有所減少，炎性細胞浸潤有所減輕，TFHL中劑量組的結(jié)構完整性最佳，灰質(zhì)內(nèi)空洞的面積和神經(jīng)元數(shù)量最接近于假手術組，TFHL高劑量組的結(jié)構完整性、空洞面積和神經(jīng)元數(shù)量介于模型組和TFHL中劑量組之間（圖5）。

圖5 SCI后7 d大鼠脊髓的組織形態(tài)變化

3 討論

SCI 通常會導致神經(jīng)元的破壞和喪失，然后是復雜的繼發(fā)性損傷，包括炎癥、氧化應激和致密膠質(zhì)瘢痕形成，繼發(fā)性損傷在初級階段后的幾秒到幾個月內(nèi)發(fā)生，對脊髓修復產(chǎn)生負面影響同時也是SCI干預的一個重要時期。其中SCI的炎癥反應包括復雜多樣的細胞和細胞活動，受損傷類型、時間和空間分布的影響[9]。SCI可誘導炎性級聯(lián)反應，包括IL-1β、IL-4、IL-10、IL-17A、TNF-α 和IFN-γ 等炎癥因子。SCI 引起的炎癥可導致SCI 病灶的擴大，使周圍區(qū)域進一步病變，進而加重脊髓功能障礙[10-11]。故在SCI 后盡快地抑制炎癥的表達有助于SCI 的修復。TFHL 作為一種被廣泛食用的植物—山楂葉的提取物，具有毒性低、安全性高和廉價等優(yōu)點，且這些特點及TFHL 在其他疾病治療上的藥效在體內(nèi)、體外和人體實驗上均已得到驗證[12-13]。在以往的研究中，TFHL 在心血管疾病治療相關研究中展示了其優(yōu)異的抗炎功能[14-15]，因此TFHL可能有治療SCI的潛能。

在本團隊之前，未發(fā)現(xiàn)有關TFHL 治療SCI 的研究，同時為了動物實驗的有效劑量更好地外推及人類，在前期研究的基礎上[16]，本研究采用灌胃的方式進行給藥。在行為學和蛋白水平上用BBB評分、RT-qPCR和ELISA等方法從行為學、基因及蛋白水平等方面探索TFHL對SCI的治療效果。本研究結(jié)果表明，所有劑量組均可促進運動功能的恢復，但劑量組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中劑量的TFHL抑制了大鼠SCI后炎癥因子IL-17A和IFNγ的產(chǎn)生且促進抗炎因子IL-4的分泌，可認為TFHL中劑量組效果更佳。組織學觀察亦展現(xiàn)了TFHL對于脊髓組織結(jié)構完整性及神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)的積極作用，相較于模型組，TFHL低、中、高劑量組的組織形態(tài)特征均更接近于假手術組，脊髓內(nèi)空洞減少，神經(jīng)元數(shù)量增多，結(jié)構更完整，其中TFHL 中劑量組最佳。

總之，這些結(jié)果表明TFHL 可能通過抗炎來促進SCI后大鼠運動功能的恢復。研究的結(jié)果為SCI的治療提供了理論基礎和一種潛在的新策略。然而，需要進一步的研究來確定潛在的治療機制，未來更需進行劑量的轉(zhuǎn)換并在SCI人群中進行相應的臨床試驗。此外，在未來的研究中，可從基因和病理結(jié)構方面對TFHL 的治療效果進行評價，亦可對TFHL單個組分和聯(lián)合組分的治療效果進行評估。