糞菌移植療法對大鼠脊髓損傷后的作用研究*

劉明富，劉 槃，寧 宇，張 瓊，農海斌，宗少暉△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，南寧 530021）

脊髓損傷（spiral cord injury，SCI）是由于脊髓結構破壞，引起脊髓神經(jīng)功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-3]，2017年調查顯示，我國SCI發(fā)病數(shù)高達37/100萬人[4]，其中北京60.2/100 萬，上海25/100 萬[5]，給社會帶來沉重負擔。SCI 后免疫細胞出現(xiàn)過度活化，免疫炎性因子如白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、補體蛋白分子等大量釋放，形成炎性因子風暴，對SCI 處組織及細胞進行暴風雨般的自殺式攻擊，給機體組織造成擴大化的損害[6-7]。因此，控制損傷部位過度的炎性反應在SCI后繼發(fā)性損傷及神經(jīng)再生等一系列重要進程中可發(fā)揮關鍵性作用。腸道菌群是位于腸道中的共生微生物群，在機體生理活動中發(fā)揮著關鍵作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群能夠影響機體免疫系統(tǒng)，在維持免疫細胞功能上發(fā)揮重要的作用，由腸道菌群失衡引起的免疫炎癥過度激活，可影響到中樞系統(tǒng)疾病[8]。近年來，糞菌移植（FMT）研究進展迅猛，一開始常用于胃腸道疾病，近些年來也開始用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[9-10]。本研究擬探討FMT 對大鼠SCI 后炎性反應的影響及可能機制，對FMT 療法能否促進SCI修復進行評價，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級成年SD 大鼠36 只，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2020-0002，動物使用許可證號：SYXK（桂）2020-0003。所有動物置于SPF級動物房內飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗循環(huán)。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本研究動物實驗符合倫理審查標準（編號：201910031），嚴格遵循“3R”原則。

1.2 SCI 模型的建立 通過改良Allen's 擊打法建立SCI模型。大鼠麻醉后，取仰臥位；以T10為中心點，切開皮膚約4 cm，分離各層組織，暴露脊髓組織，脊髓呈現(xiàn)乳白色，使用克氏針（10 g）于3.5 cm高度進行垂直擊打，此時大鼠尾巴擺動，雙后肢及軀體輕微抽搐并伸縮，脊髓迅速充血、水腫，提示造模成功。

1.3 糞菌液的制備 收集健康大鼠新鮮糞便，使用燒杯稱取10 g，加入生理鹽水50 mL充分攪拌，使用100 μm 濾網(wǎng)進行過濾，濾液以12 000 r/min 離心10 min，取沉淀加入等量生理鹽水，重復上述步驟3次，糞菌液制備完成。

1.4 實驗分組和處理 將SD 大鼠隨機分為3 組，即對照組（A組）、SCI組（B組）、FMT治療組（C組），每組12只。A組僅手術暴露，不進行擊打，B組和C組建立SCI 模型。C 組灌胃給予菌液，1 次/d，劑量為10 mL/kg，連續(xù)灌胃14 d，A組和B組灌胃給予等量生理鹽水。

1.5 腸道菌群測序 于術后14 d 收集各組糞便標本，采用16S rDNA V3-V4高度保守區(qū)進行HiSeq平臺測序。

1.6 體重和Basso-Beattie-Bresnaha（BBB）評分各組分別于術前（0 d）及術后1 d、3 d、7 d、14 d稱體重，并評估大鼠后肢功能恢復情況。BBB評分分為3個部分：（1）0～7分，評估后肢踝關節(jié)、膝關節(jié)和髖關節(jié)恢復情況；（2）8～13 分，評估后肢的承重和前、后肢協(xié)調恢復情況；（3）14～21 分，評估后肢主動爪位置與身體平行情況[11]。評分越高，表明大鼠運動功能恢復越好。

1.7 脊髓組織IL-10、IL-4 和IL-17 含量測定 術后14 d，取脊髓組織按照1∶10（g/mL）比例加入RIPA 裂解液，充分研磨后再冷孵育20 min 充分裂解，14 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測脊髓組織中IL-10、IL-17和IL-4含量。

1.8 蘇木精—伊紅（HE）染色 術后14 d，取損傷處脊髓組織用4%多聚甲醒固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片，行HE染色；沖洗，干燥，樹脂封片，顯微鏡下觀察脊髓組織病理學改變。

1.9 尼氏染色 制作病理切片（步驟同HE 染色），采用焦油紫作為核心染料，染色1 h 后用離子水沖洗，用分化劑進行脫色，乙醇脫水和二甲苯透明后用中性樹膠封片。尼氏體呈深藍紫色顆粒或斑塊狀，細胞核淡藍色，背景無色或淺藍色。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HiSeq平臺測序結果 物種累積曲線反映的是抽樣個數(shù)對物種多樣性的影響；當抽樣個數(shù)較少時，發(fā)現(xiàn)的物種并不全面，并不能表征整個群落結構，隨著抽樣個數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)的物種數(shù)越來越多，也更能表征這個群落結構。當曲線末端上升趨勢趨于平緩時，則表明采樣量足夠，見圖1A。在關鍵物種門水平差異比較結果中，B 組擬桿菌門（Bacteroidetes）和螺旋體菌門（Saccharibacteria）數(shù)量減少（P＜0.05，P＜0.01），變形菌門（Proteobacteria）數(shù)量增多（P＜0.05），表明SCI 后腸道菌群發(fā)生了改變，見圖1B。

圖1 HiSeq平臺測序結果

2.2 3 組大鼠體重比較 與A 組比較，B 組和C 組在術后1 d體重無明顯差異（P＞0.05），術后3 d、7 d、14 d 體重均明顯下降（均P＜0.05）；與B 組比較，C組于術后1 d、3 d、7 d、14 d 體重均無明顯差異（均P＞0.05），見圖2。

圖2 SCI后大鼠體重變化

2.3 3 組BBB 評分比較 與A 組比較，B 組與C 組術后1 d，3 d，7 d，14 d的BBB評分均明顯下降（P＜0.05）；與B 組比較，C 組術后1 d，3 d，7 d，14 d 的BBB評分均明顯升高（均P＜0.05），見圖3。

圖3 SCI后大鼠運動功能變化

2.4 3 組脊髓組織炎癥因子水平比較 與A 組比較，B組脊髓組織IL-10含量顯著下降，IL-17含量明顯上升（均P＜0.05），C 組IL-10 和IL-4 含量明顯上升，IL-17含量明顯下降（均P＜0.05）；與B組比較，C組IL-10 和IL-4 含量明顯上升，IL-17 含量明顯下降（均P＜0.05），見圖4。

圖4 SCI后14 d 3組脊髓組織炎癥因子水平比較

2.5 脊髓組織病理學變化 A組脊髓組織規(guī)整，細胞大小形態(tài)正常；B組在損傷處有炎性細胞浸潤，細胞數(shù)量減少，有空泡，出現(xiàn)病理性改變；C 組損傷情況明顯減輕，細胞變性水腫情況改善，見圖5。

圖5 SCI后14 d脊髓組織HE染色圖

2.6 脊髓組織神經(jīng)元形態(tài)觀察 A 組神經(jīng)元細胞形態(tài)清晰完整，胞核較大且呈圓形，有數(shù)量較多的尼氏小體；B組神經(jīng)元細胞出現(xiàn)溶解壞死，存活的神經(jīng)元形態(tài)各異大小不一，尼氏小體數(shù)量相較于A組明顯減少；C組神經(jīng)元細胞相較于B組細胞核清晰，壞死細胞減少，尼氏小體數(shù)量增多，見圖6。

圖6 SCI后14 d脊髓組織尼氏染色圖

3 討論

SCI 后的繼發(fā)性損傷是指脊髓破壞后，由免疫失衡、自由基誘導的細胞焦亡等引起的瀑布放大式組織自毀級聯(lián)反應，會導致?lián)p傷區(qū)域擴大，使癱瘓擴展到更高節(jié)段，其損毀程度遠大于脊髓破壞本身[12]。因此，抑制SCI 后由免疫失衡引起的炎癥反應對促進SCI 修復具有重要意義。16S rRNA 測序結果中，損傷組Bacteroidetes 和Saccharibacteria數(shù)量減少，Proteobacteria數(shù)量增加，使損傷組腸道菌群平衡失調。Proteobacteria包括很多病原菌，如沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等都對人體有害。而Bacteroidetes可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其作為能源物質，可糾正電解質，降低神經(jīng)膠質細胞NF-κB 的活化，進而減少促炎因子的釋放從而保護神經(jīng)元[13]，因此，糾正SCI 后的腸道菌群紊亂具有潛在的治療作用。本實驗使用FMT 治療維持腸道菌群平衡后發(fā)現(xiàn)，C 組BBB 評分比損傷組有明顯提高，提示維持腸道菌群平衡對SCI 后神經(jīng)功能恢復有促進作用。但大鼠體重經(jīng)FMT治療后并沒有顯著升高，可能的原因是治療時間不夠，體重回升較慢。HE 染色和尼氏染色結果顯示，SCI后組織存在炎性浸潤，出現(xiàn)了神經(jīng)元細胞溶解壞死，尼氏小體數(shù)量急劇減少，經(jīng)過FMT 治療后，脊髓組織中炎性反應減少，壞死細胞數(shù)量減少，尼氏小體數(shù)量增加，提示FMT 療法可改善脊髓組織的形態(tài)與功能。

免疫失衡導致的炎癥是繼發(fā)性SCI中主要的損害因素之一。SCI 時可激活神經(jīng)細胞、膠質細胞等產(chǎn)生促炎細胞因子（IL-17、TNF-α）、趨化因子（MCP-1、MCP-2）、金屬蛋白酶等，進一步攻擊脊髓組織[14]。其中IL-17 可通過激活NF-kB 信號通路促進各種細胞因子的表達[15]，引起炎性級聯(lián)放大反應，加重SCI。IL-10主要由調節(jié)性T細胞分泌，對TNFα、IL-17等促炎因子起到抑制作用，進而阻斷小膠質細胞的抗原呈遞功能以及減少星形膠質分泌炎性因子[16]。IL-4 主要由活化T 細胞產(chǎn)生，在炎癥反應中起到抗炎作用[17]，可緩解炎癥因子對脊髓組織的破壞。研究結果發(fā)現(xiàn)，SCI 組脊髓組織中的促炎因子IL-17含量上升，而抗炎因子IL-10和IL-4含量下降，經(jīng)FMT 治療后，IL-17 的釋放得到抑制，含量較SCI 組有明顯下降，而IL10 和IL-4 含量升高，提示FMT療法能夠有效抑制炎癥反應，降低脊髓繼發(fā)性損傷帶來的危害。

綜上所述，F(xiàn)MT 療法能夠降低SCI 后脊髓組織中的炎癥反應，減少由IL-17 引起的炎性級聯(lián)放大效應，通過調控免疫平衡從而抑制脊髓繼發(fā)性損傷中的炎癥反應，進而在SCI的治療中發(fā)揮重要作用。