褪黑素對布比卡因脊髓神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護的作用機制*

陳美云紫，賴 堅，羅云鵬，余 悅，周 剛，韋麗玲，劉敬臣

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

與局部麻醉藥（local anaesthetics，LA）神經(jīng)毒性相關的椎管內神經(jīng)并發(fā)癥主要包括短暫性神經(jīng)綜合征（transient neurologic syndrome，TNS）以及馬尾神經(jīng)綜合征（cauda equina syndrome，CES）,一旦發(fā)生，輕則導致住院時間延長，醫(yī)療費用增加，重則導致永久性損害，終身殘疾。但局麻藥神經(jīng)毒性的發(fā)生機制和有效的防治措施尚不明確。因此，探索局麻藥引起神經(jīng)毒性的發(fā)生機制、尋找有效治療藥物是目前迫切需要解決的問題。布比卡因作為椎管內麻醉的常用局麻藥物，具有潛在的神經(jīng)毒性作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)布比卡因神經(jīng)毒性與神經(jīng)元凋亡密切相關，但其具體機制尚未明確[1-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)小膠質細胞在神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用[4-5]，而布比卡因鞘內注射引起的神經(jīng)毒性是否與小膠質細胞有關鮮有報道。褪黑素（melatonin,MT）是一種主要有腦松果體分泌的吲哚雜環(huán)類激素，具有抗氧化、減輕炎癥反應、抗凋亡等生理作用[6]且極易通過血腦屏障。近年來，MT 的神經(jīng)保護作用受到越來越多關注，有實驗性研究證實，MT對急性脊髓損傷[7]及各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]均有神經(jīng)保護作用。而MT對布比卡因誘發(fā)的神經(jīng)毒性是否有治療作用，目前尚未見相關報道。本研究擬建立布比卡因脊髓神經(jīng)毒性大鼠模型，并觀察MT 對該模型的神經(jīng)保護作用并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

PE-10 導管購自Smith Medical 公司（英國）；布比卡因（貨號：B5274）和褪黑素（貨號：M5250）均購自Sigma 公司（美國）；CD86、Bax、IL-1β 抗體均購自沈陽萬類科技有限公司，IBA1 抗體、594 熒光二抗均購自Abcam 公司（英國），GAPDH、Bcl-2 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，Caspase-3抗體購自CST公司（美國）；RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、5×蛋白上樣緩沖液、BCA檢測試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復液、DAPI染液均購自碧云天生物科技有限公司（中國），ECL化學發(fā)光試劑盒購于沈陽萬類科技有限公司。

1.2 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠24只，體重260～280 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2020-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK 桂2020-0004。對大鼠進行分籠飼養(yǎng)，隨意獲得食物及水，并在20～25 ℃下保持12 h/12 h 明暗循環(huán)。本動物實驗已取得廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，審批號：202007057，嚴格遵循“3R原則”進行。

1.3 動物分組與給藥

按隨機數(shù)字表法把24 只SD 大鼠均分為4 組：假手術組（S 組）、生理鹽水組（N 組）、布比卡因組（B 組）、褪黑素與布比卡因共處理組（M 組），每組6只。B組及M組各鞘內注射5%布比卡因0.12 mL/kg，共3次，每次間隔90 min；M組鞘內注射后立即腹腔注射MT 12.5 mg/kg，連續(xù)3 d，每天1 次。B 組鞘內注射后立即腹腔注射與M 組等量MT 溶媒，連續(xù)3 d，每天1 次；N 組鞘內注射生理鹽水0.12 mL/kg，共3 次，每次間隔90 min，腹腔注射MT 溶媒同B組；S組鞘內置管后，不行鞘內注射，腹腔注射MT溶媒同B組。各組于給藥后3 d取材。

1.4 蛛網(wǎng)膜下腔置管動物模型的建立

采用改良Yaksh 法[9]對各組大鼠進行鞘內置管。鞘內置管前用生理鹽水沖洗無菌PE-10 導管，于L5～L6椎間隙置入。如置管過程中，大鼠出現(xiàn)甩尾反應、導管內有清亮腦脊液流出，則可證明導管在蛛網(wǎng)膜下腔。固定導管，皮下埋管于頸部引出，再次固定導管于頸部皮膚，后封口。置管后單籠飼養(yǎng)2 d，下肢出現(xiàn)運動障礙者予以剔除；其余大鼠予以鞘內注射2%利多卡因20 μL，注射后30 s 內出現(xiàn)下肢及鼠尾喪失感覺且不能活動，并于30 min內恢復者，為造模成功，否則予以剔除。成功造模的大鼠，單籠飼養(yǎng)2 d后用于后續(xù)實驗。

1.5 檢測指標

1.5.1 光鏡觀察HE染色病理學改變 各組大鼠于水合氯醛麻醉后，用4 ℃生理鹽水行心臟灌注直至肝臟發(fā)白，立即取出脊髓腰膨大組織置于4%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，后行HE 染色，顯微鏡下觀察各組脊髓組織病理學改變。

1.5.2 Western blotting法檢測各組相關蛋白表達 提取組織總蛋白，BCA 法檢測各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液混勻，煮沸變性分裝后待用；SDSPAGE 凝膠電泳使蛋白分離，后蛋白濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗：Bcl-2、Caspase-3、CD86（1∶1 000），Bax（1∶800）、IL-1β（1∶500）以及內參蛋白GAPDH（1∶5 000）4 ℃條件下過夜；TBST洗膜；二抗HRP 標記山羊抗兔（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜；ECL 化學發(fā)光發(fā)暗室曝光顯影，結果用Image J軟件分析，以目的條帶灰度值與內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值來反映對應蛋白的相對表達水平。

1.5.3 免疫熒光法檢測各組IBA1 免疫陽性細胞率量 取各組相應石蠟切片，60 ℃烤箱烤片1～2 h，脫蠟后用檸檬酸鈉行抗原修復，PBS洗片，0.5%Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗片，5%驢血清室溫封閉1 h，IBA1 一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜，PBS 洗片，羊抗鼠594 熒光二抗（1∶100）室溫避光孵育 1 h，PBS漂洗后DAPI染核室溫5 min，PBS洗片，滴加抗熒光猝滅劑蓋蓋玻片封片；于熒光顯微鏡下觀察拍照，藍色熒光為細胞核染色，代表整片所有細胞數(shù)，紅色熒光為IBA1 免疫陽性細胞數(shù)，代表小膠質細胞數(shù)量。結果用Image J軟件測定各組IBA1免疫陽性細胞數(shù)并進行分析。陽性細胞率越高，表示小膠質細胞增殖越多。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 脊髓組織病理學改變

S 組和N 組脊髓組織光鏡下未見明顯異常改變，灰質及白質結構致密，細胞排列規(guī)則，神經(jīng)元形態(tài)正常、結構完整，細胞核正常清晰，尼氏小體豐富。B 組脊髓組織損傷嚴重，灰質和白質區(qū)域有空泡形成，細胞排列紊亂，神經(jīng)元細胞水腫或萎縮，胞核固縮，尼氏小體溶解，出現(xiàn)小膠質細胞吞噬現(xiàn)象。M組脊髓組織損傷較B組輕，灰質及白質水腫空泡較少，損傷神經(jīng)元減少，見圖1。

圖1 各組HE染色光鏡下脊髓組織損傷情況

2.2 各組脊髓組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、CD86、IL-1β的蛋白表達比較

與S組比較，N組凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、小膠質細胞M1型激活相關因子CD86、炎性因子IL-1β蛋白表達無明顯差異（均P＞0.05）。與N組比較，B組和M組Bax、Caspase-3、CD86、IL-1β 蛋白表達明顯上升，Bcl-2 蛋白表達明顯下調（均P＜0.05）。與B組相比，M組Bax、Caspase-3、CD86、IL-1β 蛋白表達明顯下調，Bcl-2 蛋白表達上升（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組蛋白相對表達量比較

2.3 各組脊髓組織IBA1免疫陽性細胞率比較

與S 組相比，N 組IBA1 免疫陽性細胞率無明顯差異（P＞0.05）。與N 組比較，B 組和M 組IBA1 免疫陽性細胞率明顯升高（P＜0.05）。與B 組相比，M 組IBA1 免疫陽性細胞率明顯降低（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 各組IBA1免疫熒光染色情況

圖4 各組IBA1免疫陽性細胞率比較

3 討論

LA 因其確切的麻醉鎮(zhèn)痛效果，在臨床上被廣泛運用于椎管內麻醉。椎管內麻醉是指將LA注入蛛網(wǎng)膜下腔或者硬膜外腔，暫時阻斷神經(jīng)傳導功能，從而使該神經(jīng)支配的區(qū)域產(chǎn)生麻醉效果。但隨著臨床經(jīng)驗的積累及相關理論研究發(fā)現(xiàn)，LA 具有潛在的神經(jīng)毒性，運用于椎管內麻醉時，可導致圍術期神經(jīng)并發(fā)癥發(fā)生。神經(jīng)細胞死亡是LA神經(jīng)毒性的主要病理學改變。布比卡因作為臨床常用的蛛網(wǎng)膜下腔LA 已被證實可致神經(jīng)元凋亡[10-11]。本實驗對成年雄性SD大鼠行椎管內置管術，將5%布比卡因注入到蛛網(wǎng)膜下腔，建立布比卡因脊神經(jīng)毒性大鼠模型。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該模型大鼠于給藥后3 d損傷最嚴重[2-3]，因此，本研究在給藥后3 d處死大鼠并完成相關實驗。

小膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫活性細胞，對內環(huán)境的微小病理改變極為敏感。當神經(jīng)元受到損傷時，內源性膠質細胞會增多，這一現(xiàn)象稱為“反應性膠質增生”，這是一個涉及小膠質細胞增殖、募集和激活的過程。IBA1是小膠質細胞和巨噬細胞特異性的鈣結合蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可特異性標記小膠質細胞。研究發(fā)現(xiàn)，在急性脊髓損傷大鼠模型中可見IBA1 免疫陽性小膠質細胞增殖[12]。小膠質細胞有靜止和激活兩種狀態(tài)，其中激活狀態(tài)可分為經(jīng)典激活M1 型和交替激活M2 型。其中，被激活的M1型小膠質細胞主要釋放IL-1β等促炎因子[13]。在大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型中，M1型小膠質細胞釋放的IL-1β可導致神經(jīng)元損傷[14]。有文獻報道，將利多卡因注射到背根神經(jīng)節(jié)可引起常駐免疫細胞的激活及引起神經(jīng)炎癥[15]。CD86 高表達于M1 型小膠質細胞，常作為M1 型小膠質細胞標記物[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，S 組及N 組IBA1免疫陽性細胞數(shù)、CD86 及IL-β 蛋白表達量無明顯增多，表明置管操作及鞘內注射生理鹽水未引起小膠質細胞增殖、激活；與N組相比，B組及M組IBA1免疫陽性細胞數(shù)明顯增多、CD86及IL-1β蛋白表達量相對于N組明顯上調，表明5%布比卡因鞘內注射可導致大鼠脊髓組織小膠質細胞增殖、M1 型激活增多及IL-1β表達增多；與B組相比，M組上述各指標表達減少，表明MT可減輕5%布比卡因鞘內注射導致的小膠質細胞增殖、激活。

當受到有害刺激時，神經(jīng)細胞可發(fā)生尼氏體溶解、神經(jīng)元萎縮及脫髓鞘等基本病理改變，如病變持續(xù)發(fā)展，最終可導致神經(jīng)細胞死亡。當神經(jīng)細胞死亡后，小膠質細胞發(fā)生增生性變化，對壞死的神經(jīng)元進行包圍吞噬作用，這一過程稱為小膠質細胞的嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，S 組及N 組脊髓組織HE 染色光鏡下觀察結構致密，神經(jīng)細胞形態(tài)正常；與N組相比，B組及M組神經(jīng)細胞發(fā)生不同程度萎縮、尼氏體溶解及形態(tài)改變，嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象增多；與B組相比，M組損傷神經(jīng)細胞及嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象減少。綜上所述，表明鞘內注射5%布比卡因可導致大鼠脊髓組織及神經(jīng)細胞損傷，而MT 可減輕該損傷。Bcl-2、Bax 及Caspase-3 是常見的凋亡相關蛋白，Bcl-2 可抑制細胞凋亡的發(fā)生，Bax 可促進細胞凋亡，細胞凋亡是否發(fā)生主要由Bcl-2及Bax決定，而Caspase-3是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶。研究表明，Bcl-2 蛋白表達降低、Bax 及Caspase-3蛋白表達增多是細胞凋亡增多的跡象[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，S 組及N 組凋亡相關蛋白蛋白水平無明顯升高或降低；與N組相比，B組及M組抗凋亡分子Bcl-2 蛋白水平下調，促凋亡分子Bax、Caspase-3 蛋白水平上調；與B 組相比，M 組抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表達上調、促凋亡因子Bax及Caspase-3蛋白表達下調。表明MT 可減少5%布比卡因鞘內注射導致的大鼠脊髓細胞凋亡。

MT是主要由松果體在晝夜節(jié)律的暗相合成和分泌的激素，具有神經(jīng)保護作用。與MT 神經(jīng)保護作用相關的機制有抑制促炎細胞因子、減少氧化應激、抗細胞凋亡及鈣離子拮抗等[18]。其中，抑制促炎因子的機制與小膠質細胞密切相關，有文獻報道，MT可以通過多種信號通路抑制小膠質細胞的過度激活，減少炎癥因子和自由基的產(chǎn)生[19]。在脊髓損傷小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)MT 可以減少小膠質細胞增殖并下調IL-1β的表達，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。與上述研究結果相似，本研究發(fā)現(xiàn)MT可減輕5%布比卡因鞘內注射引起的脊神經(jīng)毒性，減少脊髓組織小膠質細胞增殖及下調IL-β蛋白表達；與上述研究結果不同在于，本研究發(fā)現(xiàn)MT下調IL-1β蛋白水平可能與抑制小膠質細胞向M1型激活相關。

本研究存在一定局限性，雖然發(fā)現(xiàn)了布比卡因的脊神經(jīng)毒性與小膠質細胞增殖及M1 型激活相關，但其具體機制尚不明確；在該模型中，M1 型小膠質細胞對神經(jīng)元細胞的確切影響也有待更深入研究。此外，已證實MT 可通過抑制小膠質細胞增殖激活及下調IL-β 對布比卡因脊神經(jīng)毒性模型大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但MT 是否通過其他途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用還有待進一步研究。本研究通過建立動物模型尋找LA神經(jīng)毒性的可能機制，為LA神經(jīng)毒性的防治提供了新的實驗思路及治療靶點。