hsa-miR-23a-3p靶向TGFβ2對急性淋巴細胞白血病CEM/C1細胞增殖、凋亡、侵襲及細胞骨架重組的影響*

白 琴，汪嘉莉△，曾 莉，胡蘭蘋，李 紅，傅銀銀

（1.四川省綿陽市中心醫(yī)院血透中心，綿陽 621000；2.四川省綿陽市中醫(yī)院腎病內科，綿陽 621000；3.成都大學附屬醫(yī)院，成都 610000）

白血病是兒童中最常見的癌癥，約占兒童癌癥的1/3[1]。兒童白血病具有兩個特點，一是惡性程度高，病情發(fā)展迅速，大多是急性，二是對化學藥物治療很敏感，癌細胞容易殺滅[2]。及時治療可治愈80%～90%的白血病兒童，后遺癥減少。盡管如此，即使治療得到改善，兒童白血病的直接和長期后果仍然造成沉重的負擔[3]。隨著分子生物學的發(fā)展，分子靶向治療為白血病的治療提供了新的途徑。microRNA 是約22 個核苷酸的小型非編碼單鏈RNA，通過與靶標mRNA的3’非翻譯區(qū)結合抑制或促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。白血病中發(fā)現(xiàn)許多異常表達的microRNA，表明microRNA可作為兒童白血病診斷和預后分析的生物標志物[5]。LncRNANEAT通過調節(jié)miR-23a-3p 表達調控急性髓細胞白血病細胞增殖和凋亡[6]。轉化生長因子β2（TGFβ2）具有調控細胞生長、分化及細胞外基質沉積的作用[7]。但miR-23a-3p 與TGFβ2 在兒童白血病中的關系目前尚無報道。本研究以急性淋巴細胞白血病細胞株CEM/C1為實驗對象，探討hsa-miR-23a-3p與TGFβ2的靶向關系，以及對CEM/C1 細胞增殖和侵襲的影響，以期為白血病的臨床治療提供可能的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 急性淋巴細胞白血病細胞株CEM/C1 細胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青—鏈霉素（15140-122）、胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司；mimicscramble、miR-23a-3p mimic、pcDNA-TGFβ2 均由上海生工生物科技公司設計合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒、LipoRNAi?轉染試劑均購自上海碧云天生物技術研究所；熒光素酶檢測試劑盒購自Solarbio公司；Transwell 購自美國Corning 公司；抗Ki67、Survivin、Caspase-3、Bax、Bcl-2、VEGF 抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將CEM/C1 細胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，用高糖RMPI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素）培養(yǎng)，每3 d 更換1次培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測miR-23a-3p和TGFβ2表達 用Trizol 提取CEM/C1 細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，miRNA 及U6 采用莖環(huán)法進行逆轉錄，TGFβ2 和GAPDH 按照常規(guī)方法通過SYBR Premix Ex Taq 說明書配置PCR 反應體系，反應條件為：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)。引物序列：miR-23a-3p 上游引物：5’-CCTTTAGGGACCGTTACACTA-3’，下游：5’-TAGTGTAACGGTCCCCTAAAGG-3’；TGFβ2 上游引物：5’-AGCAAGCTGAAGCTCACCAGT-3’，下游：5’-TTGGCGTAGTACTCTTCGTCG-3’；GAPDH 上游引物：5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’，下游：5’-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3’；U6 上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。U6 和GAPDH分別作為miRNA和mRNA基因的內參基因，用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.4 熒光素酶報告實驗 為了檢測TGFβ2 是否為miR-23a-3p 的直接下游靶基因，用熒光素酶報告實驗分析。構建野生型和突變型TGFβ2 3’UTR 熒光素酶報告基因質粒，分別與miR-23a-3p mimic 轉染至CEM/C1 細胞中，按照試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.5 細胞轉染與分組 將miR-23a-3p mimic 與pcDNA-TGFβ2單獨或聯(lián)合轉染至CEM/C1細胞，將細胞隨機分為4 組：Control 組、mimic 組、pcDNATGFβ2 組和mimic+TGFβ2 組。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染，轉染12 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，收集細胞。

1.6 克隆形成法 將CEM/C1 細胞接種至6 孔板（500 個/孔），培養(yǎng)10 d 后棄掉培養(yǎng)基，乙醇固定30 min，0.5%結晶紫染色，去離子水漂洗晾干，顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)目，計算克隆形成率。細胞克隆形成率（%）=細胞克隆總數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.7 流式細胞儀檢測凋亡 取對數(shù)生長期的各組CEM/C1細胞，胰酶消化吸收后，PBS洗滌2次，加入195 μL Annexin V-FITC 結合液重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min后用流式細胞儀檢測凋亡細胞數(shù)。

1.8 Transwell 取無血清培養(yǎng)基稀釋的人工基底膜，加入Transwell 上室，37 ℃風干。上室中加入200 μL 的細胞懸液，下室中加500 μL 的含血清DMEM 培養(yǎng)基。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棉簽擦去基質膠和上室細胞，多聚甲醛固定后染色。光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，拍照，計算侵襲細胞數(shù)。

1.9 微管形成實驗 將CEM/C1 細胞接種于48 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，顯微鏡下觀察血管生成情況，計算微管形成的結節(jié)數(shù)。

1.10 Western blotting 法檢測Ki67、Survivin、Caspase-3、Bax、Bcl-2、VEGF 蛋白表達 取CEM/C1 細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白含量；煮沸使蛋白變性，SDSPAGE 凝膠電泳法分離蛋白，轉移至PVDF 膜；4 ℃下加入Ki67、Survivin、Caspase-3、Bax、Bcl-2、VEGF（均1∶1 000）一抗孵育過夜，TBST 清洗；室溫下加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶10 000），孵育2 h，ECL 顯色。采用Image J 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 5 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-23a-3p與TGFβ2靶向關系 與Control組比較，mimic組miR-23a-3p表達升高，TGFβ2表達降低（P＜0.05），見圖1A、圖1B。通過生物信息學網站Targetscan 7.1（http://www.targetscan.org）預測到miR-23a-3p與TGFβ2具有結合位點，圖1C。熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-23a-3p mimic 組熒光素酶活性降低（P＜0.05），見圖1D。

圖1 miR-23a-3p與TGFβ2靶向關系

2.2 miR-23a-3p 靶向TGFβ2 對CEM/C1 細胞增殖的影響 與Control 組比較，mimic 組克隆形成率及Ki67、Survivin 蛋白表達量降低，pcDNA-TGFβ2 組克隆形成率及Ki67、Survivin 蛋白表達量升高；與pcDNA-TGFβ2 組比較，mimic+TGFβ2 組克隆形成率及Ki67、Survivin 蛋白表達增降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 miR-23a-3p靶向TGFβ2對CEM/C1細胞增殖的影響

2.3 miR-23a-3p 靶向TGFβ2 促進CEM/C1 細胞凋亡 與Control 組比較，mimic 組細胞凋亡率、Caspase-3 蛋白表達量和Bax/Bcl-2 比值升高，pcDNATGFβ2組細胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達量和Bax/Bcl-2 比值降低；與pcDNA-TGFβ2 組比較，mimic+TGFβ2組細胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達量和Bax/Bcl-2比值均升高（均P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-23a-3p靶向TGFβ2對CEM/C1細胞凋亡的影響

2.4 miR-23a-3p 靶向TGFβ2 對CEM/C1 細胞侵襲的影響 與Control 組比較，mimic 組侵襲細胞數(shù)減少，pcDNA-TGFβ2 組侵襲細胞數(shù)增加；與pcDNATGFβ2組比較，mimic+TGFβ2組侵襲細胞數(shù)（均P＜0.05），見圖4。

圖4 miR-23a-3p靶向TGFβ2對CEM/C1細胞侵襲的影響

2.5 miR-23a-3p 靶向TGFβ2 對CEM/C1 細胞微管結節(jié)的影響 與Control 組比較，mimic 組結節(jié)數(shù)和VEGF蛋白表達量降低，pcDNA-TGFβ2組結節(jié)數(shù)和VEGF 蛋白表達量升高；與pcDNA-TGFβ2 組比較，mimic+TGFβ2 組結節(jié)數(shù)和VEGF 蛋白表達量均降低（均P＜0.05），見圖5。

圖5 miR-23a-3p靶向TGFβ2對CEM/C1細胞微管結節(jié)形成的影響

3 討論

兒童白血病是最常見的兒童血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病，成人白血病與兒童白血病有著生物學特性、治愈率、治療反應和造血系統(tǒng)腫瘤類型等方面的不同[8]。microRNA 分子遺傳學異常已成為近年白血病的研究熱點，microRNA 可以導致mRNA 降解或抑制翻譯，因此，它們與多種生物學過程的調節(jié)相關，例如細胞周期、細胞凋亡、藥物敏感性、蛋白質轉運和血管生成。許多癌癥與改變在miRNA的表達水平相關[9]。TGFβ2 是TGFβ 家族成員之一，TGFβ 信號通路以細胞和背景依賴的方式發(fā)揮著腫瘤抑制或腫瘤促進的作用。本研究通過生物學信息發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p 與TGFβ2 存在直接靶向作用關系。說明miR-23a-3p 可介導轉化生長因子β2對白血病CEM/C1細胞的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。

骨髓內異常的原始造血細胞異常增殖是急性兒童白血病的主要臨床表現(xiàn)。miRNA 的正常表達可以調節(jié)細胞的增殖和分化，而其異常表達會導致腫瘤的發(fā)展改變[10]。Ki67 是一種指示癌癥增殖的變化的細胞核抗原，在急性白血病患者細胞中高表達[11]。Survivin 是常見的凋亡抑制蛋白家族成員，可通過抑制細胞凋亡促進細胞增殖，在急性白血病患者腫瘤組織中高表達[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p 靶向TGFβ2 具有降低CEM/C1 細胞克隆形成率和Ki67、Survivin 蛋白水平的作用。提示miR-23a-3p通過靶向TGFβ2抑制CEM/C1細胞增殖。

細胞凋亡屬于程序性細胞死亡，可通過消除舊的及受損細胞維持生物機體內生理平衡[13]。Caspase-3 參與細胞凋亡的重要信號分子，其低表達與急性白血病的發(fā)生、發(fā)展關系密切[14]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可相互作用，其形成的復合物比值的高低可判定細胞凋亡狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p靶向轉化生長因子β2具有促進細胞凋亡，升高Caspase-3蛋白水平、Bax/Bcl-2比值的作用。提示miR-23a-3p 過表達通過靶向TGFβ2 誘導CEM/C1細胞凋亡。

細胞侵襲在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，侵襲及轉移是惡性腫瘤的基本特征,細胞的遷移運動能力是腫瘤細胞侵襲轉移的重要環(huán)節(jié)，許多microRNAs均可調控癌細胞侵襲[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p 靶向轉化生長因子β2 具有抑制CEM/C1細胞凋亡的作用。提示miR-23a-3p通過靶向TGFβ2抑制CEM/C1細胞侵襲。

細胞骨架重組是血細胞分化過程的另一個重要特征，由不同的分化誘導劑誘導形成，微管則直接影響細胞有絲分裂以及細胞內物質運輸[17]。血管內皮生長因子(VEGF)是參與血管形成的關鍵因子，最早被發(fā)現(xiàn)與早幼粒白血病細胞核中，可通過作為旁分泌因子影響著白血病細胞的生物學效應[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p靶向TGF β2具有降低CEM/C1 細胞微管形成的結節(jié)數(shù)，下調VEGF 蛋白水平的作用。提示miR-23a-3p 通過靶向TGFβ2抑制CEM/C1細胞骨架重組。

綜上所述，miR-23a-3p 靶向TGFβ2 具有抑制CEM/C1細胞增殖、侵襲、細胞骨架重組、EMT，促進細胞凋亡的作用。