下調整合素β1對大腸癌細胞的西妥昔單抗化療敏感性的影響及機制研究*

張壯苗，鄧黎黎，張 巖，馬麗輝

（海南三亞市人民醫院腫瘤血液科，三亞 572000）

大腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國大腸癌的發病率和死亡率均高于世界平均水平，嚴重威脅著人民身體健康。當前大腸癌治療首選外科手術，藥物化療是術前、術后重要的輔助治療手段[1-2]。西妥昔單抗是一種針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的嵌合單克隆抗體，屬于治療轉移性大腸癌的一線化療藥物，對大腸癌有確切的抑制作用。但化療過程中，腫瘤細胞對化療藥物產生的抵抗能力使得西妥昔單抗的臨床治療效果大大降低，而難以徹底清除的腫瘤細胞引起腫瘤復發和轉移，是導致大腸癌治療失敗和患者死亡的主要原因[3]。因此，如何提高大腸癌化療敏感性一直是臨床研究重點和熱點。

整合素β1（integrin β1，ITGB1）是一種重要的黏附分子，在惡性腫瘤的進展中起重要作用，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[4]。既往研究表明，大腸癌中ITGB1 表達上調，ITGB1 高表達與大腸癌患者整體生存時間短等不良預后有關，可作為潛在預后預測因子[5]。也有研究表明ITGB1 在乳腺癌、鼻咽癌等癌細胞產生化療耐藥性中起著重要作用，靶向ITGB1可以提高紫杉醇、吉西他濱等化療藥物的敏感性[6-8]。但目前關于ITGB1 在大腸癌治療過程中改善藥物化療敏感性的研究較少，ITGB1 對西妥昔單抗敏感性的作用效果及分子機制尚不完全清楚。因此，本研究探討ITGB1表達變化對西妥昔單抗抗大腸癌化療敏感性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 患者和組織樣本收集 收集在海南三亞市人民醫院行手術切除且經病理檢查確診的56 例原發性大腸癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織。排除合并其他系統性腫瘤或腫瘤發生轉移者，排除術前接收化療或放療的患者。本研究經過醫院醫學倫理委員會批準，批準文號為：2020-1-143。所有患者均自愿簽署知情同意書。

1.2 主要材料與試劑 人大腸癌LS174T 細胞（美國ATCC 細胞庫）；RPMI1640 培養基、胎牛血清、鏈霉素與青霉素（武漢普諾賽生命科技有限公司）；西妥昔單抗（100 mg/20 mL/瓶）（德國默克里昂制藥公司）；特異性干擾ITGB1 表達的siRNA 和無干擾作用的siRNA（上海吉凱基因科技有限公司）；LipofectamineTM2000轉染試劑、Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；CCK-8試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、細胞裂解液（碧云天生物技術研究所）；SYBR Premix Ex Taq 熒光定量試劑盒、反轉錄試劑盒（日本Takala公司）；兔源Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc抗體，鼠源β-actin、GAPDH抗體，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗（美國Abcam 公司）；PVDF 膜、ECL試劑（美國Millipore公司）。

1.3 細胞培養 將大腸癌LS174T 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養傳代，取對數生長期細胞開展實驗。

1.4 細胞轉染與分組 取對數生長期LS174T 細胞，以1×105個/孔接種于24孔板，細胞培養24 h后，隨機分為5 組：空白對照組（正常培養）、NC-siRNA組（轉染無干擾作用的siRNA）、ITGB1-siRNA 組（轉染特異性干擾ITGB1 表達的siRNA）、西妥昔單抗組（終濃度為50 μg/mL的西妥昔單抗干預24 h）、ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組（轉染特異性干擾ITGB1表達的siRNA，同時用終濃度為50 μg/mL的西妥昔單抗干預24 h）。轉染操作嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行。各組轉染細胞于細胞培養箱中培養6 h 后更換新鮮培養基，繼續培養48 h后取各組細胞用于后續實驗。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測ITGB1 mRNA 表達水平 用Trizol 法提取大腸癌組織、癌旁組織及各組細胞總RNA，應用酶標儀測定RNA純度和濃度，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄合成互補鏈cDNA，應用熒光定量PCR 試劑盒進行RT-qPCR 反應。引物序列如下：ITGB1 上游引物：5’-ATGTGTCAGACCTGCCTTGG-3’，下游：5’-GCTGGGGTAATTTGTCCCGA-3’；GAPDH 上游引物：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT3’，下游：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。反應體系（20 μL）：10 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，SYBR Premix Ex Taq 11.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應條件：95 ℃60 s，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，重復40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2－△△Ct法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次。

1.6 CCK-8法檢測LS174T細胞增殖活性 將各組細胞按照1×105/mL 的濃度接種于96 孔板，置于細胞培養箱中培養24 h，每孔設置5個復孔，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，混勻后繼續在細胞培養箱孵育4 h，采用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）值，以OD值反映細胞增殖活力。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測LS174T細胞周期分布情況收集各組細胞，3 000 r/min 離心10 min 收集沉淀細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次后，加入預冷的75%乙醇固定，置于4 ℃冰箱過夜，再次離心收集細胞，PBS 沖洗2 次后，加入50 μL 水解酶RNase A，37 ℃水浴1 h，加入200 μL PI 染液避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布。實驗重復3次。

1.8 流式細胞術檢測LS174T細胞凋亡情況 收集各組細胞，調整細胞密度為2×104/mL，按200 μL/孔接種于6 孔板，每組設置5 個復孔，培養過夜，收集細胞，3 000 r/min離心10 min收集沉淀，用預冷PBS洗滌2遍，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測分析各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.9 Western blotting 法檢測LS174T 細胞凋亡相關蛋白及Hedgehog信號通路相關蛋白表達水平

收集各組細胞，用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液在冰上裂解30 min提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經10%SDS-PAGE 電泳分離，將分離的蛋白濕法轉移至PVDF膜上，室溫下在含5%脫脂牛奶的TBST 緩沖液中封閉1 h，TBST 緩沖液洗滌3 次×10 min，分別加入兔源Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 一抗（1∶1 000）和鼠源β-actin、GAPDH 一抗（1∶1 000）在4 ℃冰箱孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次×10 min，加入相應HRP標記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（1:5 000）在室溫下孵育1 h。采用ECL 試劑顯影，分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.10 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行實驗數據處理分析，實驗結果以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ITGB1 在大腸癌組織中表達水平 大腸癌組織中ITGB1 mRNA 相對表達量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 ITGB1在大腸癌組織中表達水平

2.2 轉染后LS174T 細胞ITGB1 mRNA 表達水平比較 轉染48 h 后，NC-siRNA 組和西妥昔單抗組LS174T細胞ITGB1 mRNA相對表達量與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；ITGB1-siRNA組和ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組LS174T細胞ITGB1 mRNA 相對表達量均顯著低于空白對照組（P＜0.05）；ITGB1-siRNA 組和ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組LS174T細胞ITGB1 mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 轉染后LS174T細胞ITGB1 mRNA表達水平比較

2.3 ITGB1 表達下調對西妥昔單抗抑制大腸癌細胞增殖活性的作用 NC-siRNA組細胞增殖活性與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組細胞增殖活性顯著低于空白對照組（P＜0.05）；ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組細胞增殖活性顯著低于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），見圖3。

圖3 ITGB1 表達下調對西妥昔單抗抑制大腸癌細胞增殖活性的作用

2.4 ITGB1 表達下調對西妥昔單抗阻滯大腸癌細胞G2/M周期的作用 與空白對照組比較，NC-siRNA組細胞周期分布無明顯差異（P＞0.05），ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組細胞阻滯于G2/M 期，該期細胞數量顯著升高（P＜0.05），S期細胞數量顯著降低（P＜0.05），G0/1 期細胞數量無明顯變化（P＞0.05）。ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組G2/M 期細胞數量顯著高于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），S期細胞數量顯著低于ITGB1-siRNA組和西妥昔單抗組（P＜0.05），G0/1 期細胞數量無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 ITGB1表達下調對西妥昔單抗阻滯大腸癌細胞G2/M周期的作用

2.5 ITGB1 表達下調對西妥昔單抗促進大腸癌細胞凋亡的作用 與空白對照組比較，NC-siRNA 組細胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組細胞凋亡率、Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達量均顯著高于ITGB1-siRNA組和西妥昔單抗組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達量顯著低于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），見圖5。

圖5 ITGB1表達下調對西妥昔單抗促進大腸癌細胞凋亡的作用

2.6 ITGB1 表達下調對西妥昔單抗調控大腸癌細胞Hedgehog 信號通路相關蛋白表達的作用 與空白對照組比較，NC-siRNA 組SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；ITGB1-siRNA+西妥昔單抗組SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc蛋白表達量均顯著低于ITGB1-siRNA 組和西妥昔單抗組（P＜0.05），見圖6。

圖6 ITGB1表達下調對西妥昔單抗調控大腸癌細胞Hedgehog信號通路相關蛋白表達的作用

3 討論

大腸癌在我國發生風險較高，且大部分患者在確診時腫瘤已發生轉移，導致治療難度增加，患者預后差[9]。目前大腸癌的治療以手術和化療為主，西妥昔單抗是大腸癌的常用化療藥物，以西妥昔單抗為主的聯合化療或綜合治療也是大腸癌治療的臨床常用方案。西妥昔單抗是一種靶向分子藥物，主要通過與EGFR 的胞外結構域結合，阻斷細胞內信號轉導通路的激活，調控腫瘤細胞增殖和凋亡；該藥還可競爭性阻斷EGFR 與其配體的相互作用，阻斷EGFR 下游信號轉導通路，進而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[10-11]。但當化療藥物使用次數增多或作用時間過長時，腫瘤細胞會產生耐藥性，致使西妥昔單抗等化療藥物達不到預期效果。因此深入研究大腸癌耐藥的相關分子機制是提高西妥昔單抗等藥物化療敏感性的主要途徑之一。

大量研究證實，整合素在腫瘤進展及耐藥性產生中的作用受到廣泛關注，其中ITGB1在多種惡性腫瘤中高表達并促進腫瘤細胞侵襲、轉移[12-13]。在肝癌、腎癌中，ITGB1 通過調控ROCK1、Mcl-1 等表達促進細胞增殖、遷移和侵襲[14-15]，而在食管鱗癌和乳腺癌中，ITGB1 是腫瘤耐藥的重要效應因子[16-17]。本研究結果顯示，ITGB1 在大腸癌組織中高表達，ITGB1 表達下調顯著增強西妥昔單抗抑制大腸癌細胞增殖、阻滯細胞G2/M 周期及誘導細胞凋亡的作用（P＜0.05）。此外，本研究結果顯示，下調ITGB1表達并給予西妥昔單抗干預后，大腸癌細胞中促凋亡蛋白Cleaved caspase-3 和Bax 表達顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調（P＜0.05），表明ITGB1 表達下調能夠顯著增強西妥昔單抗調控大腸癌細胞凋亡蛋白表達的作用，提示ITGB1表達下調可增強大腸癌細胞對西妥昔單抗的化療敏感性。

Hedgehog 信號通路在人體發育和各種生理過程中起著重要調控作用，多數情況下該信號通路處于高度抑制狀態，一旦發生失調則容易引發腫瘤。Hedgehog通路中信號傳導取決于SHh蛋白的表達，低SHh信號條件下，SHh與Ptch1結合減少，Gli活性發生改變，出現轉錄抑制因子的功能，而在高SHh信號條件下，SHh 與Ptch1 結合，Gli 保持原有活性，行使轉錄激活功能，激活的Hedgehog通路介導下游多種生長因子表達，引起細胞分裂和修復受損DNA的原癌基因c-Myc 表達水平上調，從而引起一系列細胞反應，最終調控細胞增值、分化、轉移、凋亡和化療耐藥性產生等生物學過程[18-19]。相關研究報道，Hedgehog 通路在大腸癌細胞遷移、侵襲以及化療耐藥性中發揮重要作用[20-21]。Song等[22]研究發現ITGB1 能夠通過調節Hedgehog 通路介導大腸癌細胞生物學行為。本研究結果顯示，ITGB1 表達下調聯合西妥昔單抗顯著下調大腸癌細胞中SHh、Gli1、Ptch1、c-Myc 蛋白表達（P＜0.05）。提示ITGB1 表達下調可能通過抑制Hedgehog 信號通路增強大腸癌細胞對西妥昔單抗的化療敏感性。

綜上所述，ITGB1 表達下調能夠顯著增強西妥昔單抗對大腸癌細胞的增殖抑制、周期阻滯及誘導凋亡作用，其機制可能與抑制Hedgehog信號通路的活性有關。本研究為大腸癌的治療和耐藥機制的研究提供了新思路，但本研究僅在細胞水平開展研究，且未應用通路抑制劑證實，后續還需更多的實驗研究作進一步的證實。