木香烴內酯對潰瘍性結腸炎小鼠腸道免疫炎癥的影響及其機制*

宋 潔，郭瑞芳，聶 虹，千巴圖

（內蒙古自治區人民醫院 1.消化內科；2.臨床營養中心，呼和浩特 010050）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種臨床常見的炎癥性腸病，以結腸黏膜及黏膜下層潰瘍及炎癥為主要病理表現[1]。目前研究表明，腸道菌群紊亂狀態會引起腸黏膜屏障損害，并導致炎癥細胞因子失衡，加重腸黏膜炎性損傷[2]。Th1/Th2細胞亞群的平衡失調致T 細胞向Th1 轉化是導致UC 發病的關鍵環節[3]。Th1 型細胞因子的過度分泌還可激活Toll 樣受體4（TLR4）/核轉錄因子-κB（NF-κB）信號途徑，TLR4/NF-κB 激活后又能誘導促炎細胞因子表達，加劇受損組織炎癥反應[4]。木香烴內酯是木香的主要藥效成分，具有抗炎、抗潰瘍活性，對小鼠急性胃潰瘍具有明顯改善作用[5-6]。然而，關于木香烴內酯對UC 作用的研究報道較少，本研究通過建立UC小鼠模型，觀察木香烴內酯對UC的治療作用，并探討其調節腸道菌群及Th1/Th2 平衡，抑制TLR-4/NF-κB活化而發揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 小鼠50 只，雄性，體質量18～22 g，飼養于清潔級實驗動物房中。實驗方案經內蒙古自治區人民醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物及試劑

木香烴內酯購自成都瑞思芬生物科技；葡聚糖硫酸鈉（DSS）購自MP Biomedicals；柳氮磺吡啶（SASP）購自上海福達制藥；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒購自深圳達科為；總RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自碧云天生物；一抗TLR-4、NF-κB p65、β-actin 購自Cell Signaling Technology(CST)。

1.3 造模與給藥

50只小鼠隨機分為5組：空白組、模型組、SASP組、木香烴內酯低、高劑量組，每組10只。采用自由飲用2.5%的DSS 溶液7 d 建立UC 模型。木香烴內酯低、高劑量組分別給予20 mg/kg、40 mg/kg 灌胃，SASP 組參照文獻[7]給予200 mg/kg 灌胃，空白組、模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，持續7 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般狀態觀察及疾病活動度指數（DAI）評分每天觀察小鼠精神、體重、糞便性狀狀況，測定糞便隱血情況。參照文獻[8]進行DAI評分：體質量未下降為0分，下降1%～5%為1分，下降6%～10%為2分，下降11%～15%為3分，下降＞15%為4分；糞便干，性狀正常為0分，糞便半稀狀，不黏肛門為2分，糞便稀，黏肛門為4 分；隱血陰性為0 分，隱血陽性為2 分，肉眼血便為4 分。DAI=（體重下降評分+糞便性狀評分+隱血情況評分）/3。

1.4.2 結腸長度及組織病理學觀察 小鼠摘眼球取血并處死，取結腸組織測量全結腸長度，取部分組織包埋，切片后行蘇木精—伊紅（HE）染色，參照Boirivant 等[9]標準進行病理組織評分：正常為0 分；極低炎性細胞浸潤為1 分；少量炎性細胞浸潤為2 分；中量炎性細胞浸潤，腸壁增厚、血管密集為3 分；大量炎性細胞浸潤，腸壁破壞，血管密集明顯為4分。

1.4.3 腸道菌群情況觀察 取小鼠新鮮糞便約0.05 g置于無菌培養瓶，以1∶100加入稀釋液，稀釋至10-8g/mL。選擇不同稀釋度（10-3～10-7）糞便樣本由高稀釋度向低稀釋度分別滴種于乳酸桿菌（LBS）、雙歧桿菌（BS）及大腸桿菌（EMB）培養基，用滅菌的L 棒將稀釋液均勻涂抹于平皿上，厭氧菌放于厭氧箱中37 ℃培養3 d，需氧菌于恒溫箱中37 ℃培養3 d，計算各培養皿的菌落數，結果以每克糞便中菌落對數值表示。

1.4.4 血清中細胞因子含量檢測 小鼠摘眼球取血，分離血清，參照ELISA 試劑盒步驟檢測IL-6、TNF-α、IL-10水平。加入標準品40 μL，抗體100 μL，血清樣品10 μL，37 ℃孵育1 h，洗板6 次，加入顯色液100 μL，37 ℃避光15 min，加入50 μL 終止液，于450 nm下檢測。

1.4.5 結腸組織mRNA 表達檢測 取結腸組織50 mg，Trizol 法提取組織總RNA，測定RNA 濃度，合成cDNA后進行PCR擴增，以β-actin為參照。擴增條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增40 個循環。用相對定量2-△△Ct法分析mRNA表達量。基因引物序列，見表1。

表1 各基因引物序列

1.4.6 結腸組織蛋白表達檢測 取結腸組織10 mg，裂解后提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。加入10 μL 蛋白樣品，電泳分離，轉膜，封閉2 h，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，加入ECL 顯影液，凝膠成像系統曝光，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據統計分析，計量資料以均值±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般狀況及DAI評分比較

造模期間各組小鼠均未出現死亡。空白組小鼠精神狀態好，進食飲水及二便正常。模型組從造模第3 天出現體重減輕、懶動、食量減少、大便次數增加、糞便呈糊狀且隱血陽性；實驗第7天上述癥狀加重，大便稀，出現肉眼血便，體重減輕更明顯。模型組DAI 評分較空白組顯著升高（P＜0.01）。木香烴內酯低、高劑量組及SASP 組體重減輕趨勢較為緩和，稀便及血便癥狀較模型組明顯減輕，DAI評分明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），提示木香烴內酯對UC 小鼠的健康狀況及癥狀具有明顯改善效果，見表2。

表2 各組小鼠DAI評分比較 n=10，

表2 各組小鼠DAI評分比較 n=10，

與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 小鼠結腸長度比較

結腸長度縮短為UC 主要特征之一，統計各組結腸長度可見，模型組結腸長度較空白組明顯縮短（P＜0.01）。木香烴內酯低、高劑量組和SASP 組小鼠結腸長度較模型組顯著增長（P＜0.05，P＜0.01），表明木香烴內酯能明顯改善DSS誘導的UC結腸縮短，見表3。

表3 各組小鼠結腸長度比較 n=10，

表3 各組小鼠結腸長度比較 n=10，

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.3 小鼠結腸組織病理學改變

空白組小鼠結腸黏膜上皮結構正常，黏膜未見炎細胞浸潤。模型組黏膜結構嚴重受損，腸壁水腫，黏膜、黏膜下層及肌層炎性細胞浸潤明顯。木香烴內酯及SASP 治療后，結腸組織病變明顯減輕。木香烴內酯低劑量組仍可見炎性細胞浸潤，但黏膜結構相對完整。木香烴內酯高劑量組和SASP組黏膜結構基本正常，炎性細胞顯著減少。模型組病理組織評分較空白組明顯升高（P＜0.01），木香烴內酯低、高劑量組和SASP 組明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。表明木香烴內酯對UC結腸炎癥癥狀具有較好的改善效果，見圖1。

圖1 小鼠結腸組織形態學改變（HE染色，×400）

2.4 小鼠腸道菌群數量比較

UC 腸道菌群可出現明顯紊亂，主要表現為優勢菌群數量減少、機會致病菌增加，最終加重免疫炎癥反應，加劇UC進展，檢測各組腸道菌群分布可見，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌數量較空白組明顯減少，大腸桿菌數明顯增加（P＜0.01）。木香烴內酯低、高劑量組和SASP 組雙歧桿菌和乳酸桿菌數量較模型組顯著增加，大腸桿菌數量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。提示木香烴內酯可通過調節腸道菌群的平衡發揮對UC的治療作用，見表4。

表4 各組小鼠糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌數量比較 n=10，，CFU/g

表4 各組小鼠糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌數量比較 n=10，，CFU/g

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.5 小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的含量

模型組血清TNF-α、IL-6 含量較空白組明顯升高，IL-10水平明顯降低（P＜0.01）。木香烴內酯低、高劑量組和SASP組TNF-α、IL-6含量較模型組顯著降低，IL-10 含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。提示木香烴內酯可下調Th1 細胞因子表達，上調Th2細胞因子表達，以減輕UC 的Th1/Th2 失衡狀態，見表5。

表5 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量比較 n=10，

表5 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量比較 n=10，

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.6 小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 的mRNA表達

模型組結腸組織中IL-6、TNF-α 的mRNA 表達較空白組明顯增多，IL-10 表達明顯減少（P＜0.01）。木香烴內酯低、高劑量組和SASP 組IL-6、TNF-α 的表達較模型組明顯減少，IL-10 表達明顯上調（P＜0.05，P＜0.01），與血清水平趨勢一致，提示木香烴內酯能夠改善UC Th1/Th2失衡狀態，見表6。

表6 各組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA比較 n=10，

表6 各組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA比較 n=10，

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.7 小鼠結腸組織中TLR-4、NF-κB p65 的蛋白表達

模型組結腸組織中TLR-4、NF-κB p65 的蛋白表達較空白組顯著增多（P＜0.01），木香烴內酯低、高劑量組和SASP組TLR-4、NF-κB p65表達較模型組顯著減少（P＜0.01）。提示木香烴內酯可通過抑制TLR4/NF-κB的激活來調節腸道免疫，減輕UC炎性損傷，見圖2。

圖2 小鼠結腸組織中TLR-4、NF-κB p65的表達

3 討論

UC 患者普遍可見腸道菌群紊亂，腸道菌群的長期失調狀態會引起腸道黏膜屏障損害，加重腸黏膜炎性損傷[2]。研究表明，CD4+T 淋巴細胞中的Th1/Th2 細胞亞群平衡失調是促使UC 發病的關鍵環節，而腸道菌群的紊亂又可加劇Th1/Th2 免疫失衡，加速UC 進展[3]。UC 活動期，T 細胞向Th1 細胞轉化，Th1細胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-2等促炎因子占優勢。TNF-α 是UC 致病的關鍵因子，能夠刺激IL-6 表達，促使凝血酶形成，使腸道發生微循環障礙，還可觸發中性粒細胞向結腸組織聚集，導致組織損傷。抗TNF-α 抗體已作為炎癥性腸病的治療靶標被廣泛應用[10]。此外，TNF-α、IL-6 等細胞因子的過表達可促使TLR4/NF-κB 炎癥信號活化，TLR4/NF-κB途徑激活后又能誘導促炎細胞因子表達，不斷加劇受損組織炎癥反應[4]。Th2 型細胞以IL-4、IL-10 等抑炎因子為主，能夠抑制Th1 細胞的分化，發揮抗炎作用[11]。研究發現，UC 進展中伴隨著IL-10水平降低，其水平下調導致抑炎作用減弱，加重結腸炎性損傷[12]。

木香性溫，味辛苦，具有行氣調中，止痛，健脾之功效。臨床研究發現，以木香為主要藥味的香連丸、陳香露白露片等成方制劑對潰瘍性病變具有良好療效[13-14]。木香烴內酯是木香中提取的主要藥效組分，現代藥理證明，其具有抗炎、抗潰瘍、調節胃腸功能等多種作用[5]。謝余等[6]發現，木香烴內酯對乙醇誘導的胃潰瘍小鼠具有良好的抗潰瘍活性。繆志偉等[7]研究表明，木香烴內酯能有效降低急性胃潰瘍小鼠血清TNF-α、NF-κB的水平，提示其可通過抑制炎癥反應發揮對胃潰瘍的保護作用。

本研究結果顯示，木香烴內酯可有效改善UC小鼠DAI 評分，增加結腸長度，減輕結腸病理損傷。細菌培養結果表明，木香烴內酯干預促進了小鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖，并明顯抑制大腸桿菌增殖，提示其能通過調節腸道菌群平衡發揮對UC 的治療作用。同時，小鼠TNF-α、IL-6 的血清和mRNA水平明顯降低，IL-10水平明顯升高，結腸組織中TLR-4、NF-κB p65 的蛋白表達亦得到有效抑制。說明木香烴內酯能改善UC 小鼠Th1/Th2失衡狀態，減輕因Th1 優勢狀態引起的炎性損傷。TNF-α、IL-6 水平的下調又抑制了TLR-4/NF-κB 炎癥途徑活化，從而阻斷了TLR-4/NF-κB 對Th1 型細胞因子的正反饋調節。

總之，木香烴內酯對UC 小鼠具有明顯的治療作用，其作用機制可能是改善腸道菌群失調，促進Th1/Th2平衡，抑制TLR-4/NF-κB活化，從而減輕腸黏膜炎性損傷。