銀杏內(nèi)酯B對抑郁樣行為大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的調(diào)控作用*

苑曉偉，王 燕，許 彬

（1.烏魯木齊市安寧醫(yī)院精神科，烏魯木齊 830023；2.中國南方航空股份有限公司新疆分公司航衛(wèi)中心健康管理室，烏魯木齊 830000；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心理醫(yī)學科，烏魯木齊 830054）

抑郁癥是臨床常見的心理疾病，以顯著且持久的心情低落為主要臨床特征，患者通常表現(xiàn)出絕望、悲觀、自卑、抑郁等癥狀。流行病學研究表明，全球抑郁癥發(fā)病率為4.4%，而中國人群的抑郁癥發(fā)病率也高達4.2%，并呈現(xiàn)出逐年升高趨勢[1]。作為一種長期心理性疾病，抑郁癥給患者及家庭帶來了巨大的精神負擔，如不及時治療，患者可能會產(chǎn)生悲觀厭世，嚴重者可能會產(chǎn)生自殺傾向和行為，因此，對于抑郁癥的及時干預(yù)和治療十分重要[2]。目前普遍認為，包括海馬組織在內(nèi)的多種組織損傷與抑郁癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，患者長期處于抑郁狀態(tài)會發(fā)生炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷等全身反應(yīng)或局部病理性改變，進而導致抑郁癥加重[4]。目前臨床上對于抑郁癥的治療主要采用心理干預(yù)及藥物治療的手段。銀杏內(nèi)酯B是從銀杏葉提取得到的單體化合物，具有顯著的神經(jīng)保護作用，且對于海馬組織的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷有較好的修復(fù)作用[5]。本研究旨在探討銀杏內(nèi)酯B 對抑郁樣大鼠的作用及其機制，為抑郁癥治療藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 銀杏內(nèi)酯B（上海研生實業(yè)有限公司，貨號15291-77-7），使用蒸餾水配制成濃度為6 mg/kg 的溶液。氟西汀（常州四藥制藥有限公司，批號201910101），使用蒸餾水配制成1 mg/kg的溶液。白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；大鼠過氧化氫酶（CAT）ELISA試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒購自上海古朵生物科技有限公司。NF-κBP65、TNF-α、IL-1β、GAPDH兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗動物 72 只SD 大鼠，雄性，SPF 級，6～8周齡，體重180～220 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0002，飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h明暗循環(huán)。

1.3 實驗分組及抑郁樣行為大鼠模型的建立 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為正常對照組、模型組、氟西汀組及銀杏內(nèi)酯B 低、中、高劑量組，每組12只。正常對照組不作處理，其他各組采用慢性應(yīng)激刺激法建立抑郁樣行為大鼠模型[6]，具體步驟：將每只大鼠置于籠中單獨飼養(yǎng)，并隨機給予以下應(yīng)激刺激，包括4 ℃冷水強迫游泳5 min、鼠籠45°傾斜放置24 h、92 dB噪聲干擾2 h、夾尾1 min、24 h連續(xù)照明、水及食物剝奪24 h、濕墊料24 h。每天選取其中一種刺激，同一刺激不連續(xù)進行，共刺激5周。以大鼠直立次數(shù)、跨越方格數(shù)（曠場實驗）及糖水偏愛度（糖水實驗）顯著降低視為造模成功。應(yīng)激刺激5周后，銀杏內(nèi)酯B低、中、高劑量組分別按照15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg[7]灌胃給予銀杏內(nèi)酯B，氟西汀組按照10 mg/kg[8]灌胃給予氟西汀，正常對照組及模型組給予等量生理鹽水，1 次/d，連續(xù)給藥6 周[8]。末次給藥結(jié)束24 h后進行后續(xù)實驗。

1.4 曠場實驗 將大鼠置于40 cm×80 cm×80 cm方形箱內(nèi)，箱底部用黑色筆劃分為25 個小方格，將大鼠逐一放置在箱底中央方格內(nèi)，通過攝像機記錄每只大鼠5 min 內(nèi)的運動行為，計算大鼠直立次數(shù)及跨越方格數(shù)。每只大鼠實驗結(jié)束后清洗方箱內(nèi)壁及底面，并用70%酒精消毒。

1.5 糖水實驗 在每只大鼠的飼養(yǎng)籠中分別放置自來水和10 g/L 的蔗糖水，大鼠適應(yīng)48 h 后，禁水6 h，再次放置自來水和10 g/L 的蔗糖水，分別記錄蔗糖水及自來水的攝入量，計算大鼠糖水偏愛度。糖水偏愛度=蔗糖水攝入量/（蔗糖攝入量+水攝入量）×100%。

1.6 血清IL-1β 和TNF-α 水平測定 大鼠麻醉后，腹主動脈取血，室溫靜置1 h，離心10 min，取上層血清，采用ELISA 法測定大鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平。

1.7 海馬組織PGE2、CAT、SOD及ROS水平測定頸椎脫臼法處死大鼠后，分離大鼠海馬組織，在含有蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液中研磨，4 ℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清，采用ELISA 法檢測大鼠海馬組織中PGE2、CAT、SOD和ROS水平。

1.8 海馬組織病理學檢查 頸椎脫臼法處死大鼠后，取海馬組織，包埋，切片，梯度乙醇脫蠟、水化，行蘇木精—伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察各組海馬組織病理學改變。

1.9 RT-qPCR 法檢測大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 及IL-1β mRNA 相對表達量 用Trizol 提取大鼠海馬組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PCR 試劑盒檢測NF-κBP65、TNF-α 及IL-1β mRNA相對表達量，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。PCR 引物序列如下：NF-κBP65 上游：5’-CGGGAATTCTAGATCGTCT-3’，下游5’-GGGGTACCATCTTGGCGTCG-3’；TNF-α 上游：5’-CAACACAAACCCCAAGTCCT-3’，下游：5’-CAGGTTCCTCCTGAGACTGC-3’；IL-1β上游：5’-CCCATGCTGGATATTTGCTT-3’，下游：5’-TCAGGTTCACCCAGTGACAA-3’；GAPDH 上游：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，下游：5’-TGATGGCAACAATGTCCACT-3’。PCR引物設(shè)計及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.10 Western blotting 法檢測大鼠海馬組織NFκBP65、TNF-α 及IL-1β 蛋白表達 取大鼠海馬組織，加入裂解液，勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清；BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量后，取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜；室溫封閉1 h，加入一抗NF-κBP65、TNF-α及IL-1β（均1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3 次；經(jīng)辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST 溶液洗膜3 次。ECL發(fā)光液顯色，自動曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 1.4.0 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.11 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 6 組大鼠直立次數(shù)及跨越方格數(shù)比較 給藥前，與正常對照組比較，模型組、銀杏內(nèi)酯B各劑量組及氟西汀組大鼠直立次數(shù)及跨越方格數(shù)均明顯減少（P＜0.05）；給藥后，與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B各劑量組大鼠直立次數(shù)及跨越方格數(shù)均明顯增加（均P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表1。

表1 6組大鼠直立次數(shù)及跨越方格數(shù)比較 ，n=12

表1 6組大鼠直立次數(shù)及跨越方格數(shù)比較 ，n=12

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B低劑量組比較，aP＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B中劑量組比較，bP＜0.05。

2.2 6 組大鼠糖水偏愛度比較 給藥前，與正常對照組比較，模型組、銀杏內(nèi)酯B各劑量組及氟西汀組大鼠糖水偏愛度明顯降低（P＜0.05）；給藥后，與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 各劑量組大鼠糖水偏愛度明顯升高（均P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表2。

表2 6組大鼠糖水偏愛度比較 ，n=12

表2 6組大鼠糖水偏愛度比較 ，n=12

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B低劑量組比較，aP＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B中劑量組比較，bP＜0.05。

2.3 銀杏內(nèi)酯B 對抑郁樣行為大鼠血清IL-1β 及TNF-α 水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β 及TNF-α 水平明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 各劑量組大鼠血清IL-1β及TNF-α水平明顯降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表3。

表3 6組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較 pg/mL，，n=12

表3 6組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較 pg/mL，，n=12

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B低劑量組比較，aP＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B中劑量組比較，bP＜0.05。

2.4 6組大鼠海馬組織PGE2、CAT、SOD 和ROS 水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織PGE2水平和ROS相對水平明顯升高，CAT、SOD水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B各劑量組大鼠海馬組織PGE2水平和ROS相對水平明顯降低，CAT、SOD水平明顯升高（均P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表4。

表4 6組大鼠海馬組織PGE2、CAT、SOD及ROS水平比較 ，n=12

表4 6組大鼠海馬組織PGE2、CAT、SOD及ROS水平比較 ，n=12

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B低劑量組比較，aP＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B中劑量組比較，bP＜0.05。

2.5 銀杏內(nèi)酯B 對抑郁樣行為大鼠海馬組織病理改變的影響 正常對照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常，細胞排列整齊，細胞核清晰，無明顯病理性改變；與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織細胞排列不整齊，海馬組織細胞核固縮；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B各劑量組和氟西汀組大鼠海馬組織病理形態(tài)明顯改善，見圖1。

圖1 大鼠海馬組織病理學改變（HE，×400）

2.6 6 組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相對表達量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 各劑量組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA 相對表達量均明顯降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表5。

表5 6 組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相對表達量比較 ，n=12

表5 6 組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相對表達量比較 ，n=12

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B低劑量組比較，aP＜0.05；與銀杏內(nèi)酯B中劑量組比較，bP＜0.05。

2.7 6 組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β蛋白表達量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B各劑量組大鼠海馬組織NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達量明顯降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 6組大鼠海馬組織NF-κBP65、IL-1β和TNF-α蛋白相對表達量比較

3 討論

銀杏內(nèi)酯B 是從銀杏科植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉中提取分離得到的化合物，具有顯著的認知功能改善、神經(jīng)修復(fù)和抗神經(jīng)元細胞凋亡作用[9-10]。劉娜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路，上調(diào)HIF-1α 表達，進而修復(fù)神經(jīng)細胞損傷；王軍等[12]則報道了銀杏內(nèi)酯B 對缺氧引起的新生大鼠神經(jīng)元凋亡的抑制作用；張艷艷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B 能夠通過降低炎癥反應(yīng)并促進血管新生，進而提高大鼠認知功能；萬芬等[13]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B 甲基苯丙胺引起的小膠質(zhì)細胞活化，并抑制其炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

抑郁樣行為與海馬組織損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等病理性改變有關(guān)，其中PGE2、CAT、SOD 和ROS是反應(yīng)組織細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的指標[14]。研究表明，抑郁小鼠海馬組織PGE2 水平升高會降低氟西汀的治療效果[15]。大鼠體內(nèi)PGE2 水平升高，海馬組織CAT 和SOD 水平降低與抑郁樣行為的發(fā)生有關(guān)[16-18]。蔡蕭君等[19]研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織ROS 水平升高會導致神經(jīng)元細胞凋亡，加重大鼠抑郁樣行為的發(fā)生，而降低海馬組織ROS水平則能夠顯著恢復(fù)海馬組織氧化應(yīng)激損傷，改善大鼠抑郁情緒。本研究中，模型組大鼠海馬組織PGE2 水平和ROS 相對水平升高，CAT、SOD 水平降低，而銀杏內(nèi)酯B 各劑量組大鼠海馬組織PGE2水平和ROS相對水平呈劑量依賴性降低，CAT和SOD水平呈劑量依賴性升高。提示銀杏內(nèi)酯B可能通過抑制海馬組織氧化應(yīng)激促進大鼠抑郁的改善。

NF-κBP65、IL-1β 和TNF-α 是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的指標。NF-κBP65 水平的升高會導致炎癥因子誘導的吲哚胺-2,3-過氧化酶的激活，進而導致抑郁的發(fā)生[20]。曲蘇晨等[21]研究表明，抑制NF-κBP65水平能夠促進小鼠抑郁狀態(tài)的恢復(fù)。在抑郁癥的發(fā)病及進展過程中，血清和組織中IL-1β、TNF-α 水平的升高也起到至關(guān)重要的作用。秦淑英等[22]臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者體內(nèi)IL-1β 和TNF-α 水平的升高會導致患者神經(jīng)細胞因子和單胺類遞質(zhì)代謝異常，加重患者疾病進展，而抑制患者體內(nèi)IL-1β和TNF-α水平則能夠顯著改善患者的抑郁癥狀。趙岳等[23]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α水平的升高是導致產(chǎn)后抑郁發(fā)生的重要因素，降低IL-1β 和TNF-α 水平有助于改善患者抑郁狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF-α 和IL-1β 水平、海馬組織NFκBP65、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達量顯著升高，而銀杏內(nèi)酯B能夠呈劑量依賴性地降低抑郁樣行為大鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平，同時降低海馬組織NFκBP65、TNF-α和IL-1β蛋白表達量。提示銀杏內(nèi)酯B 可能通過降低大鼠全身炎癥反應(yīng)，減少海馬組織炎癥因子的產(chǎn)生，改善大鼠的病理變化，糾正抑郁行為。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B 能夠顯著降低抑郁樣行為大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，抑制大鼠抑郁樣行為加重，緩解大鼠抑郁狀態(tài)。