血清炎癥因子G-CSF、MCP-1、IP-10在支氣管肺發(fā)育不良患兒中的表達(dá)及臨床意義*

李如偉，王瑞華，唐碧波，謝書暢，鐘麗花

（海南西部中心醫(yī)院 1.兒科；2.檢驗(yàn)科，儋州 571700；3.海南省婦幼保健院新生兒科，海口 571100）

近年來，隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，早產(chǎn)兒的存活率顯著升高[1]。支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）逐漸成為早產(chǎn)兒高發(fā)病率、高病死率的主要因素[2]。BPD主要臨床表現(xiàn)為喂養(yǎng)困難、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩及肺功能異常等，病理表現(xiàn)為肺組織大量白細(xì)胞浸潤(rùn)、肺纖維化等。目前認(rèn)為，BPD 的發(fā)生與感染、肺高氧損傷等因素有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致肺微小血管發(fā)育障礙及組織修復(fù)障礙[3]。但BPD的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，臨床上缺少早期診斷及治療的手段。宮內(nèi)感染、機(jī)械通氣等因素導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)是BPD 發(fā)生發(fā)展過程中的重要生物學(xué)過程，涉及機(jī)體大量細(xì)胞因子、趨化因子及補(bǔ)體等的表達(dá)平衡失調(diào)[4]。粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）又稱集落刺激因子3（CSF3），是一種造血細(xì)胞因子，在機(jī)體內(nèi)主要由單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等分泌產(chǎn)生，能夠促進(jìn)粒細(xì)胞生成，調(diào)節(jié)粒細(xì)胞功能。單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP1）屬于CC家族趨化因子成員，是單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的趨化因子，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程。干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（inducible protein-10，IP-10）屬于CXC 家族趨化因子，能夠刺激單核細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞遷移。大量研究表明，在肺部感染、慢性阻塞性肺氣腫及呼吸衰竭等血清GCSF、MCP-1、IP-10水平均存在表達(dá)失衡的現(xiàn)象，進(jìn)而促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞及粒細(xì)胞向炎癥部位募集，在殺傷病原體的同時(shí)可能造成肺組織損傷[5-7]。本研究通過檢測(cè)早產(chǎn)兒不同時(shí)間段血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平，探討三者在BPD中的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018 年1 月至2019 年9 月本院新生兒科診治的126例早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胎兒胎齡＜32周和（或）出生體重≤1 500 g。（2）BPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2001 年美國(guó)國(guó)家兒童健康與人類發(fā)展研究所制定的標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并復(fù)雜先心病或呼吸系統(tǒng)畸形。（2）合并苯丙酮尿癥或其它遺傳代謝性疾病。（3）臨床資料不完整。根據(jù)病情分度標(biāo)準(zhǔn)[8]，將126例早產(chǎn)兒分為非BPD 組48 例，BPD 組78 例，其中輕度BPD 組（糾正胎齡36 周未用氧）30 例，中度BPD 組（糾正胎齡36周需用氧，F(xiàn)iO2＜30%）31例及重度BPD組（糾正胎齡36 周需用氧，F(xiàn)iO2≥30%或需機(jī)械通氣）17 例。各組早產(chǎn)兒一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過，且患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組早產(chǎn)兒血清G-CSF、MCP-1、IP-10 水平 取早產(chǎn)兒生后1 d、14 d 和28 d 外周血約1.5 mL，室溫靜置1 h 后，2 500 rpm/min離心10 min，分離上層血清，-80 ℃保存待測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，人G-CSF、MCP-1、IP-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司（貨號(hào)SEKH-0058、SEKH-0236、SEKH-0036）。實(shí)驗(yàn)步驟：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔加入樣本，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體室溫孵育1 h，加洗滌液洗滌5 次，加入底物液A、B 后室溫避光孵育15 min，加終止液后450 nm 波長(zhǎng)的OD 值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算對(duì)應(yīng)樣本的濃度值。

1.3 低劑量地塞米松激素（DART）治療 對(duì)已明確診斷為BPD 的早產(chǎn)兒，除常規(guī)予以呼吸管理、循環(huán)管理、營(yíng)養(yǎng)支持治療及支氣管擴(kuò)張劑、利尿劑等藥物治療外，在矯正胎齡36 周時(shí)采集外周血，予以低劑量地塞米松治療。總療程10 d。初始劑量0.15 mg/kg，3 d；0.10 mg/kg，3 d；0.05 mg/kg，2 d；0.02 mg/kg，2 d。治療結(jié)束后再次取中、重度BPD 組患兒外周血對(duì)G-CSF、MCP-1、IP-10水平進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。不符合正態(tài)分布資料以中位數(shù)表示[M（P25，P75）]，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作曲線（ROC）分析血清G-CSF、MCP-1、IP-10 水平對(duì)BPD 的診斷價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較 與非BPD 組相比，BPD組早產(chǎn)兒胎齡和出生體重均較小，5 min Apgar評(píng)分較低，機(jī)械通氣時(shí)間和總吸氧時(shí)間較長(zhǎng)，新生兒肺炎和新生兒窒息發(fā)生率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組在宮內(nèi)窘迫史、胎膜早破史、性別、1 min Apgar 評(píng)分比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較

2.2 BPD 組與非BPD 組不同時(shí)間點(diǎn)血清G-CSF、MCP-1、IP-10 水平比較 BPD 組與非BPD 組早產(chǎn)兒生后第1，14 和28 天各時(shí)間點(diǎn)血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平進(jìn)行比較，與非BPD組相比，BPD組各時(shí)間點(diǎn)血清G-CSF、MCP-1及IP-10水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BPD 組早產(chǎn)兒生后血清G-CSF、MCP-1 及IP-10 水平的表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0 05），見表2。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平比較

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平比較

2.3 不同程度BPD 早產(chǎn)兒血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平比較 重度BPD組早產(chǎn)兒在第14天和第28天時(shí)血清G-CSF、MCP-1 及IP-10 水平明顯高于輕度、中度BPD組早產(chǎn)兒（均P＜0.05），見表3。

表3 不同程度BPD早產(chǎn)兒血清G-CSF，MCP-1，IP-10水平比較

表3 不同程度BPD早產(chǎn)兒血清G-CSF，MCP-1，IP-10水平比較

與重度組相比，*P＜0.05。

2.4 血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平對(duì)BPD早期診斷價(jià)值 以非BPD組為參照，以第1天和第14天早產(chǎn)兒血清G-CSF、MCP-1、IP-10 水平為變量，繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，第1 天血清G-CSF、MCP-1、IP-10 的AUC 分別為0.763、0.751 及0.766，第14 天血清G-CSF、MCP-1、IP-10 的ROC 曲線下面積（AUC）分別為0.913、0.925及0.867，第14天血清GCSF、MCP-1、IP-10 水平對(duì)于BPD 具有較高的診斷價(jià)值，見表4，圖1。

圖1 ROC 曲線分析第1 天（A）、第14 天（B）早產(chǎn)兒血清GCSF、MCP-1、IP-10水平對(duì)BPD的診斷價(jià)值

表4 血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平對(duì)BPD早期診斷價(jià)值

3 討論

BPD 的發(fā)生是患兒本身在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，由各種環(huán)境因素如高濃度吸氧或高壓機(jī)械通氣等造成不成熟的肺組織的損傷。存活的BPD患兒，特別是重度BPD 患兒，遠(yuǎn)期可發(fā)生肺動(dòng)脈高壓、智力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，嚴(yán)重影響患兒的生命質(zhì)量[9]。因此，研究BPD 疾病發(fā)生機(jī)制，尋找能夠早期診斷BPD及判斷治療療效的血清標(biāo)志物，對(duì)于預(yù)防及治療BPD，減少重度BPD 的發(fā)生，具有重要的公共衛(wèi)生意義及臨床價(jià)值。

BPD 的發(fā)生與高氧造成的急性肺損傷關(guān)系密切，肺損傷進(jìn)而引起氣道的炎癥過程。高氧性肺損傷導(dǎo)致氧自由基的釋放，大量活性氧損傷肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致肺水腫。高氧性肺損傷過程中常伴有顯著的炎癥反應(yīng)，大量炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等的大量浸潤(rùn)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的活性氧，損傷肺組織[10]。G-CSF 作為一種促炎性細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞及粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生。以往研究報(bào)道，肺部炎癥發(fā)生早期，患者血清G-CSF水平表達(dá)顯著上調(diào)，參與促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，加重肺組織的損傷[11]。本研究中，BPD早產(chǎn)兒血清G-CSF 水平顯著上調(diào)，并且BPD 程度越重，G-CSF水平升高程度越顯著。提示G-CSF參與促進(jìn)BPD早產(chǎn)兒病情的發(fā)生發(fā)展。以往研究報(bào)道，BPD組織中存在大量的粒細(xì)胞等細(xì)胞浸潤(rùn)，粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量G-CSF，促進(jìn)組織炎癥的發(fā)生[12]。有學(xué)者在慢性阻塞性肺氣腫中發(fā)現(xiàn)，G-CSF的表達(dá)能夠直接誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞分泌產(chǎn)生如組織蛋白酶3、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和髓過氧化物酶等，進(jìn)而加重肺組織損傷[13-14]。因此，G-CSF 在BPD 的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的促進(jìn)作用，檢測(cè)BPD 患兒血清GCSF 水平有助于BPD 疾病嚴(yán)重程度的判斷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第14 天血清G-CSF 對(duì)BPD 具有較高的診斷價(jià)值，表明檢測(cè)第14天血清G-CSF水平有助于早期診斷BPD。

IP-10是由炎癥微環(huán)境中單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等多種炎細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，具有趨化并激活單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及T 細(xì)胞的重要趨化因子。MCP-1是一種趨化因子，可招募并激活單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。它在以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，促進(jìn)單核細(xì)胞向動(dòng)脈壁的募集。近年來研究表明，MCP-1、IP-10 在人類多種肺部疾病中，如肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞及新冠肺炎等疾病中均存在表達(dá)異常升高的現(xiàn)象[15-16]。本研究中，BPD 早產(chǎn)兒血清MCP-1、IP-10 顯著升高，并且兩者升高的程度與BPD 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。表明BPD 中MCP-1、IP-10 參與促進(jìn)BPD 的疾病進(jìn)展。有研究表明，高潮氣量的機(jī)械通氣可增加Ly-6C 陽性表達(dá)炎性單核細(xì)胞在肺組織中的積累，而阻斷MCP-1的配體C-C趨化因子受體2則可顯著降低Ly-6C陽性表達(dá)的炎性單核細(xì)胞的遷移并減少Ly-6C 陽性炎性單核細(xì)胞在肺部的聚集[17]。表明MCP-1 可能是促進(jìn)BPD 發(fā)展的重要趨化因子。另一方面，有研究表明，IP-10 不僅具有單核細(xì)胞趨化功能，還具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的生物學(xué)功能，進(jìn)而加重BPD時(shí)肺組織的損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒第14 天血清MCP-1、IP-10 水平對(duì)BPD 具有較高的診斷價(jià)值，同時(shí)具有較高的診斷敏感性及特異性。提示第14 天血清MCP-1、IP-10 有助于臨床早期診斷BPD，早產(chǎn)兒血清MCP-1、IP-10 水平有望成為新的BPD的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，BPD患兒血清G-CSF、MCP-1、IP-10水平升高，并且血清G-CSF、MCP-1、IP-10升高的程度與BPD 疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，檢測(cè)早產(chǎn)兒血清GCSF、MCP-1、IP-10水平有助于BPD的早期診斷。