海藻酸鈉對O-羧甲基殼聚糖/阿拉伯膠復凝聚反應的影響

周穎，滕靜，李曉丹，劉亮，肖軍霞

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

復凝聚反應是指兩種帶相反電荷的生物大分子通過靜電吸引相互作用產生沉淀的一種自發現象[1-2]，目前在食品領域研究最多的復凝聚體系是多糖/蛋白質體系和多糖/多糖體系，已報道的有黃原膠/殼聚糖[3]、阿拉伯膠/殼聚糖（gum arabic/chitosan，GA/CTS）[4]、海藻酸鈉（sodium alginate，SAL）/殼聚糖[5-6]和 O-羧甲基殼聚糖（O-carboxymethyl chitosan，O-CMC）/GA等。王津等[7]分別對GA/CTS和GA/O-CMC復凝聚體系包埋5-氟尿嘧啶和殺蟲劑啶蟲脒的最佳工藝、微膠囊穩定性和芯材釋放性能進行了初步研究。Espinosa-Andrews等[8]對GA/CTS復凝聚體系在食品領域的應用進行了較為系統的研究，確定了復凝聚相中兩種大分子的組成對復凝聚反應的影響，并對復凝聚相的表面結構和流變學性質進行了系統研究。孫燕婷等[9]確定了GA和CTS復凝聚反應的最佳工藝，在一定條件下制備的GA/CTS復凝聚相具有較好的腸道靶向釋放性能，可以作為水包油型乳液的微囊化壁材。但目前尚未見到SAL對O-CMC/GA復凝聚反應及復凝聚相性質影響的研究。

本研究主要探討添加SAL對O-CMC/GA復凝聚反應及復凝聚相性質的影響，同時采用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和動態流變儀等手段對制備的復凝聚相進行表征，以確定添加SAL對復凝聚相功能性質的影響。本研究對于開發新型功能的多糖/多糖復凝聚體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CTS（脫乙酰度 95.2%、黏度 500 mPa·s、食品級）：濰坊海之源有限公司；SAL（CP）、GA（食品級）、氫氧化鈉（AR）：上海國藥集團化學試劑有限公司；氯乙酸（AR）：天津巴斯夫有限公司；鹽酸、無水乙醇、異丙醇（AR）：萊陽市康德化工有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

UV-2000紫外可見分光光度計：上海尤尼科儀器有限公司；Mar-90恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；SPS401F萬分之一分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；DL-5-B低速大容量離心機：上海安亭儀器設備廠；ZDG-0.25真空冷凍干燥機：煙臺冰輪股份有限公司；NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；200PC差示掃描量熱儀：德國耐施儀器公司；JSM-7500F掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社；Delta320 pH計：瑞士梅特勒托利多公司；MCR102動態流變儀：奧地利安東帕有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復凝聚相的制備

根據Chen等[10]的方法制備O-CMC，通過滴定法確定其取代度為0.35。稱取不同質量比的GA和SAL，將其分別溶于去離子水中定容至100 mL，然后等體積混合攪拌均勻，制成不同濃度的GA-SAL溶液，置于4℃冰箱中保存待用。將一定濃度的O-CMC溶液與GA-SAL溶液混合，調節pH值，于特定溫度下反應1h，4 000r/min離心20 min得到O-CMC/GA-SAL復凝聚相。

1.3.2 復凝聚反應的檢測

1.3.2.1 濁度

復凝聚反應結束后，將反應液倒入1 cm的比色皿中，迅速在600 nm處測定吸光度，以去離子水作為對照。

1.3.2.2 復凝聚相產率

待復凝聚反應完成后，4 000 r/min離心20 min，收集復凝聚相，于50℃下干燥至恒重，按下式計算復凝聚相產率。

1.3.3 復凝聚反應條件的優化

1.3.3.1 pH值對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響

將1%的O-CMC溶液與5%的GA-SAL溶液（其中GA與SAL的質量比為99∶1）等體積混合，使混合液的總固形物濃度達到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調節混合液的pH值至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和 6.5，25 ℃下反應 1 h，測定反應體系的濁度和復凝聚相產率。

1.3.3.2 溫度對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響

將1%的O-CMC溶液與5%的GA-SAL溶液（其中GA與SAL的質量比為99∶1）等體積混合，使混合液的總固形物濃度達到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調節混合液的pH值至3.0，分別置于4、25、35、45、55 ℃下反應 1 h，測定反應體系的濁度和復凝聚相產率。

1.3.3.3 O-CMC與GA-SAL質量比對兩者復凝聚反應的影響

將1%的O-CMC溶液分別與1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的GA-SAL混合溶液（其中GA與SAL的質量比為99∶1）等體積混合，此時O-CMC與GA-SAL質量比分別為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 和 1∶5。用 0.1 mol/L 的NaOH或HCl溶液調節溶液的pH值至3.0，25℃下反應1 h，測定反應體系的濁度和復凝聚相產率。

1.3.3.4 SAL含量對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響

將一定量的SAL與GA分別溶于去離子水后混合使其總濃度達到4%，GA與SAL的質量比分別為99∶1、74∶1、49∶1 和 24∶1。將上述 GA-SAL 溶液與 1%O-CMC溶液等體積混合，使混合液總固形物濃度達到2.5%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調節溶液的pH值至3.0，25℃下反應1 h，測定反應體系的濁度和復凝聚相產率。

1.3.4 復凝聚相的表征

將1%的O-CMC溶液與4%的GA-SAL混合溶液（其中GA與SAL的質量比為74∶1）等體積混合。采用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調節混合液的pH值至 3.0、4.5、6.0，25℃下反應 1 h，4 000 r/min 離心20 min，收集復凝聚相進行表征。

1.3.4.1 DSC分析

對 O-CMC、GA、SAL及 O-CMC/GA-SAL 復凝聚相凍干粉進行DSC分析。取5 mg樣品，分別加入到DSC樣品盒中，以空白盒為參照，試樣在氮氣保護下，以5℃/min的速率從30℃加熱到300℃，通過計算機記錄加熱過程中的差熱曲線。

1.3.4.2 SEM分析

對O-CMC/GA-SAL復凝聚相凍干樣品進行SEM分析。掃描電鏡樣品制備方法：在樣品臺上貼一層雙面膠，分別將不同條件下的復凝聚相放置于樣品臺上，然后在樣品上噴金供SEM觀察，電壓為2kV。

1.3.4.3 流變學特性

對O-CMC/GA-SAL復凝聚相的流變學性質進行研究。將樣品置于校正好的動態流變儀平臺上，在（30±0.2）℃下，用錐板（1°）對樣品在黏彈性范圍內進行頻率掃描和觸變測試，板間距離d=0.1 mm。

1.4 統計分析

每個試驗重復3次，結果以平均值±標準差形式表示。采用SPSS統計軟件（SPSS Statistics 17.0.1）進行t檢驗和方差分析，當p＜0.05時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 復凝聚反應條件的優化

2.1.1 pH值對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響

pH值會影響聚電解質之間的電荷平衡，是影響復凝聚反應的一個重要因素。pH值對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響見圖1。

圖1 pH值對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響Fig.1 Effect of pH on the complex coacervation of O-CMC/GASAL

由圖1可知，pH值對O-CMC與GA-SAL之間的復凝聚反應有重要影響。復凝聚相產率隨著pH值的增加呈先升高后降低的趨勢，在pH值為3.0時達到最大值57.30%，說明在此pH值下O-CMC與GA-SAL的復凝聚反應程度最大。這一結果及變化規律與OCMC/GA復凝聚反應體系一致，即在pH3.0時兩者之間的復凝聚反應最強[11]，反應體系中添加一定量的SAL對O-CMC/GA的最適復凝聚反應pH值沒有影響。由圖1可知，反應體系的濁度在pH5.0達到最大值，但在pH3.0較小，這與復凝聚相產率的結果不一致。這可能是由于在pH3.0時復凝聚反應非常充分，所形成的復凝聚相聚焦程度高、粒徑大，導致它們在短時間內發生復凝聚反應并沉淀，從而使測得的上清濁度偏低。另外，從圖1還可以看出，O-CMC、GA及SAL在試驗所選擇的濃度下于600 nm下均無光吸收，因此在隨后的研究中均不再測定這3種聚電解質的吸光度。

2.1.2 溫度對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響

除了靜電吸引之外，聚電解質之間的氫鍵和疏水性相互作用在復凝聚相的形成中也起著重要作用。高溫有利于疏水性相互作用，而低溫則可以促進氫鍵相互作用[12]。溫度對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響見圖2。

圖2 溫度對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響Fig.2 Effect of temperature on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由圖2可知，溫度對O-CMC/GA-SAL之間的復凝聚反應有重要影響，4℃下復凝聚相的產率最高，為63.2%；此后隨著反應溫度的升高，復凝聚相產率隨之下降。反應體系的濁度則在25℃時最高，此后隨著反應溫度的降低或升高均呈現降低的趨勢。結果表明低溫有利于O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的發生，說明氫鍵可能在復凝聚相的形成中起到了重要作用。由于25℃時產率僅比4℃下低5.8%，且25℃下進行復凝聚反應簡單易行，因此選擇25℃為復凝聚反應溫度進行后續研究。

2.1.3 O-CMC與GA-SAL質量比對兩者復凝聚反應的影響

聚電解質之間的配比對于溶液中的靜電平衡有重要影響，因此就pH3.0下O-CMC與GA-SAL質量比對兩者復凝聚反應的影響進行研究，結果見圖3。

圖3 O-CMC/GA-SAL質量比對兩者復凝聚反應的影響Fig.3 Effect of biopolymer ratio on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由圖3可知，O-CMC/GA-SAL質量比對兩者的復凝聚反應有重要影響，過大或過小均不利于復凝聚反應的發生。隨著兩者混合比例的增加，復凝聚相產率呈現出先增加后降低的趨勢，當兩者質量比為1∶4時復凝聚產率最大，達到了71.8%；而反應體系的濁度在兩者質量比為1∶2時達到最大，在1∶4時較小，其原因可能為當O-CMC與GA-SAL質量比為1∶3和1∶4時，反應體系復凝聚相的聚集程度最大，迅速形成沉淀，導致測定的濁度降低；當兩者的混合比例隨之增加或降低時，由于復凝聚相聚集程度降低，大部分復合物呈懸浮狀態，雖然復凝聚相的產率有所降低，但是測得的濁度仍然較高。當兩者的質量比為1∶1時，由于復凝聚相產率過低，兩者的相互作用程度較弱，形成的復凝聚相較少，導致濁度最低。因此選擇O-CMC與GA-SAL質量比為1∶4進行后續試驗。

2.1.4 SAL含量對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響

GA-SAL復合物中SAL含量對復凝聚反應的影響見圖4。

圖4 SAL含量對O-CMC/GA-SAL復凝聚反應的影響Fig.4 Effect of SAL content on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由圖4可知，隨著GA-SAL復合物中SAL所占比例的降低，復凝聚相產率呈現先降低后增加的趨勢且在質量比為74∶1時達到最大；當質量比為99∶1時復凝聚相產率不再顯著變化。這是由于復凝聚反應的最適pH值為3.0，該pH值低于SAL中古羅糖醛酸和甘露糖醛酸的解離常數（3.20和3.38）[13]，因此SAL攜帶的負電荷含量較少甚至不帶電荷而無法參與復凝聚反應，導致復凝聚相產率隨著SAL含量的增加而降低。添加不同量SAL時所得復凝聚相的濁度無顯著性差異。當GA與SAL復合物的質量為99∶1時，復凝聚相產率最高為70.4%。考慮到GA與SAL質量比為99∶1和74∶1時復凝聚相產率的差異不顯著，采用質量比74∶1進行后續研究。

2.2 復凝聚相的表征

2.2.1 DSC分析

O-CMC/GA-SAL復凝聚相的DSC分析結果如圖5所示。

圖5 不同pH值下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的DSC圖譜Fig.5 DSC patterns of O-CMC/GA-SAL complex coacervates separated in different pH

由圖5可知，所有的O-CMC/GA-SAL復凝聚相均出現了兩個吸熱峰和一個放熱峰。第一個吸熱峰可歸因于水分的蒸發，第二個吸熱峰是由于破壞基團之間的靜電相互作用和復凝聚相的網絡結構需要吸收能量引起的[14-15]，而放熱峰是由于O-CMC分解所致[16]。

O-CMC/GA-SAL復凝聚相峰值溫度見表1。

表1 O-CMC/GA-SAL復凝聚相峰值溫度Table 1 Peak temperatures of O-CMC/GA-SAL coacervats in DSC thermogram

由表1可知，O-CMC/GA-SAL復凝聚相第一吸熱峰溫度隨著pH值增大而降低，這可能是由于復凝聚相在制備過程中，隨著pH值的升高，羧基和水分子的氫鍵作用力隨之降低，使得第一吸熱峰溫度隨著pH值增加而降低。O-CMC、GA、SAL均沒有出現第二吸熱峰，但是三者發生復凝聚反應后在220℃左右均出現了吸熱峰，該吸熱峰是由于靜電相互作用被破壞所致，因此DSC分析證實了三者之間發生了復凝聚反應。pH6.0時所得復凝聚相的放熱峰溫度（276.96℃）明顯高于其它兩個pH值，說明O-CMC/GA-SAL復凝聚相的熱穩定性隨著pH值的增加而提高。

2.2.2 SEM分析

當SAL含量占聚陰離子總量的1/75時，在pH3.0、4.5、6.0條件下制備所得O-CMC/GA-SAL復凝聚相的微觀結構分別如圖6所示。

圖6 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的掃描電鏡圖Fig.6 SEM micrographs of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由圖6可知，在3個pH值下制備的O-CMC/GASAL復凝聚相均具有明顯的多孔網絡結構，且隨著復凝聚反應pH值的上升，O-CMC/GA-SAL復凝聚相網絡結構的致密度有所增加，且孔穴的孔徑逐漸減小。通過與未添加SAL的O-CMC/GA復凝聚相相比[17]，添加SAL后復凝聚相的網絡結構更加規則，孔徑分布更加均勻，說明此時的復凝聚相更適合用于敏感成分的包埋。

2.2.3 流變學特性

2.2.3.1 O-CMC/GA-SAL復凝聚相的觸變特性

O-CMC/GA-SAL復凝聚相的觸變特性見圖7。

圖7 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的觸變特性Fig.7 Thixotropic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates prepared at pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由圖7可知，在不同pH值條件下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相均為假塑性流體[18]，即隨著剪切速率的增加，黏度迅速降低，說明復凝聚相具有剪切變稀特性；當剪切應力撤銷時，復凝聚相的結構重新排列，下行線始終低于上行線，黏度僅部分恢復[19]。說明復凝聚相在受到外力時，復凝聚相的空間網絡結構重新排列，形成了新結構，并且新結構的穩定性低于之前的結構。

反應pH值對復凝聚相的觸變特性具有一定影響。pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的起始黏度明顯大于pH3.0下制備的復凝聚相，這可能是由于O-CMC和GA之間的復凝聚反應逐漸增強所致。當pH4.5及pH6.0條件下所得的復凝聚相的黏度在剪切力逐漸降低時均極低，在剪切力的作用下其結構被破壞，當外力撤銷時無法恢復到初始黏度。

2.2.3.2 O-CMC/GA-SAL復凝聚相的黏彈性

在不同pH值下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的黏彈特性見圖8。

圖8 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的黏彈特性Fig.8 Viscoelastic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由圖8可知，O-CMC/GA-SAL復凝聚相在剪切頻率逐漸增加的過程中儲能模量始終大于損失模量，表現出類似固體彈性行為[20]。不同pH值下形成的復凝聚相黏彈性有所差異。在剪切頻率增加過程中，在pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復凝聚相的儲能模量和損失模量明顯大于pH3.0下制備的復凝聚相。這表明可以通過調節反應的pH值來獲得具有特定黏彈性的O-CMC/GA-SAL復凝聚相。

3 結論

通過探討SAL對O-CMC/GA復凝聚反應及復凝聚相性質的影響，以確定添加SAL對復凝聚相功能性質的影響。結果表明，與O-CMC/GA體系相比，添加SAL對其最適反應條件無顯著影響，即最適反應條件為pH3.0、O-CMC與GA-SAL質量比1∶4、反應溫度25℃、反應時間1 h。SAL的含量對O-CMC/GA-SAL復凝聚相的微觀結構有一定影響，隨著SAL含量的增加，復凝聚相的網絡結構更加致密；含SAL的O-CMC/GA復凝聚相均為假塑性流體，且主要表現出固體彈性性質，這對于開發多糖/多糖復凝聚體系新功能具有重要意義。