白芍花提取工藝及功能性飲料的研究

徐睿，李美景，劉榮，冉紅燕，龍玉婷，熊麗娟，謝凱莉，龔慕辛*

（1.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；2.中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069）

白芍花是毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥花蕾，為中藥白芍的非藥用部位，是種植中藥的副產物，具有很高的觀賞價值[1]和藥食兩用價值[2]。但在藥用芍藥栽培過程中，其花常常被當作廢棄物，造成資源浪費[3]。白芍花常用來治療因內分泌紊亂引起的雀斑、黃褐斑、暗瘡，可延緩皮膚衰老，促進新陳代謝，提高機體免疫力[4]。研究顯示上述作用與其所含有的花色苷、黃酮、單萜苷和酚酸類成分有關[5-8]。前期研究測定了不同栽培品種及干燥工藝白芍花的體外抗氧化、抑制酪氨酸酶、胰脂肪酶活性以及其中芍藥苷、芍藥內酯苷、沒食子酸等9種活性成分含量[9]，發現栽培品種“亳州芍藥”烘干品的綜合活性以及活性成分含量最高，同時建立了各活性與9種成分的相關關系，確定了對上述活性有益的正向成分和不利的負向成分及對各活性的影響系數。目前以同屬毛茛科、芍藥屬的牡丹花為原料的食品研究類型很多[10]，但對于白芍花尤其是飲料類型的產品研發較少，本研究擬在此基礎上開發一種白芍花提取物飲料，拓展白芍花的用途。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白芍花：采集于白芍主產區安徽亳州，經首都醫科大學中醫藥學院李佳副教授鑒定為毛茛科植物芍藥的干燥花蕾，在60℃下熱風烘干。

對照品芍藥苷[（paeoniflorin，PF）批號L26A0003，純度≥95%]、沒食子酸[（gallic acid，GA）批號BD09A036，純度≥98%]、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷[（quercetin-7-O-β-D-glucoside，Qu7G） 批號 BC08A031，純度≥98%]、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷[（quercetin-3-O-β-D-glucoside，Qu3G）批號 BA25B061，純度≥98%]、紫云英苷[（kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside，Km3G）批號BF27A070，純度≥98%]、芍藥內酯苷[（albiflorin，AF）批號 CI17B213，純度≥95%]、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷[（isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside，Is3G）批號BF27A033，純度≥95%]：成都普思生物科技股份有限公司；山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷[（kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside，Km7G）批號 D01S9S69103，純度≥98%]：上海源葉生物科技有限公司；芍藥素-3，5-O-β-二葡萄糖苷[（peonidin-3，5-O-β-diglucopyranoside，Pn3G5G）批號 0509/0-02，純度≥95%]：法國EXTRASYNTHESE公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國Fisher公司；甲酸、95%乙醇（均為分析純）：北京化工廠；液相用水為純凈水。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）（1260 infinity Ⅱ型）：美國安捷倫公司；微波萃取裝置（P70D20TL-D4型）：佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司；1/10萬電子天平（DV215CD型）：美國奧豪斯公司；1/100電子天平（TP-402型）：丹佛儀器（北京）有限公司；超聲波清洗器（KQ-500E型）：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀（J1811252型）：北京西沖科技發展有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS-11-6型）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

稱取亳州芍藥干燥花蕾20 g，粉碎（過100目篩），按照單因素試驗和正交試驗的不同方案進行提取，兩層濾紙抽濾，在60℃水浴下減壓濃縮至無醇味，以70%乙醇定容至100 mL，超聲混勻10 min，精密量取5 mL溶液至蒸發皿中，在85℃水浴上揮干，加適量甲醇溶解殘渣并定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜，得質量濃度為0.04 g/mL的白芍花甲醇溶液。

1.3.2 9種活性成分含量的測定

參考前期試驗方法，并進行一定調整[9]。精密稱取9種對照品，用甲醇溶解得到對照品母液。分別取適量對照品母液混合，加甲醇定容得到的初始濃度分別為 0.525 0、0.198 0、0.500 0、0.645 0、0.179 0、0.100 0、0.288 0、0.125 0、0.110 0 mg/mL 的 GA、Pn3G5G、AF、PF、Qu7G、Qu3G、Km3G、Is3G、Km7G 混合對照品溶液，依次稀釋得到不同濃度的其它混合對照品溶液。將上述混合對照品溶液依次進樣，在275、525、230、350 nm 4種波長下測定其峰面積，以各成分色譜峰面積為縱坐標，以對照品中各成分的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。將供試品溶液按相同方法操作，通過已鑒定出的9種成分所對應的峰面積，計算樣品中相應的含量。

1.3.3 提取物活性綜合評分的計算

根據前期對白芍花9種有效成分的化學成分及其活性進行相關分析，得到各成分體外抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性、抑制胰脂肪酶活性標準化系數K，其中對活性有正向作用的成分K值為正，負向作用的成分K值為負。隨后對各活性成分含量進行歸一化處理，以各成分含量的歸一化值di與標準化系數Kij（i為各成分，j為各活性指標）乘積之和作為多成分轉換成的某一活性值，即活性j（j分別為抑制酪氨酸酶、抑制胰脂肪酶、抗氧化活性），其中抗氧化的活性j取抗氧化1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法、鐵離子還原法以及二銨鹽法三者活性j的均值，而每個樣品3個活性j之和即為該樣品的活性綜合評分，計算公式為：活性j=∑Kidi。

1.3.4 工藝流程

亳州芍藥干燥花蕾→適度破碎→70%乙醇浸泡→微波輔助提取→過濾→濃縮→添加輔料→裝瓶→冷卻→滅菌→檢驗→成品

1.3.5 工藝要點

1.3.5.1 提取方式的選擇

根據1.3.2方法測定3種提取方法測得9種活性成分含量，并按照1.3.3方法計算不同提取方式所得白芍花提取液的綜合評分。1）加熱回流法：準確稱量粉碎后亳州芍藥干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h。2）溫浸法：準確稱量粉碎后亳州芍藥干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇在60℃水浴下浸提2次，每次1 h。3）微波輔助提取法：準確稱量粉碎后亳州芍藥干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇常溫浸泡30 min，微波功率為480 W，提取時間為4 min（分4次，每次1 min，冷卻至45℃再提取），提取2次。提取物用兩層濾紙抽濾，合并濾液，旋轉蒸發至少量溶液后，用70%乙醇定容至100 mL，即得樣品溶液。

1.3.5.2 單因素試驗

根據提取工藝試驗結果，固定提取方式為采用微波輔助提取，以綜合評分為指標進行單因素試驗。固定料液比為 1∶15（g/mL），先常溫浸泡 30 min，微波功率為480 W，提取時間為4 min，提取2次，考察乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%）對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分數為70%，先常溫浸泡30 min，微波功率為480 W，提取時間為4 min，提取2次，考察料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分數為70%，料液比為1∶15（g/mL），先常溫浸泡30 min，提取時間為4 min，提取2次，考察功率（160、320、480、560 W）對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分數為70%，料液比為1∶15（g/mL），先常溫浸泡30min，微波功率為480W，提取時間為4min，考察提取次數（1、2、3、4次）對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分數為70%，料液比為1∶15（g/mL），先常溫浸泡30 min，微波功率為480 W，提取2次，考察提取時間（1、2、3、4 min）對樣品綜合評分的影響。

1.3.5.3 提取工藝正交試驗

根據單因素試驗結果，固定提取次數為3次，確定以提取時間（A）、微波功率（B）、料液比（C）、乙醇體積分數（D）為試驗因素進行正交試驗，因素水平見表1。

表1 提取工藝正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction process

1.3.6 白芍花提取物飲料配方優化正交試驗

根據前期單因素試驗考察結果，初步確定加水稀釋倍數為 5倍，以阿斯巴甜（a）、檸檬酸（b）、乙基麥芽酚（c）添加量為試驗因素進行正交試驗，每個因素3個水平，因素水平設計見表2。

表2 配方優化正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for formula optimization

邀請10名同學和老師為感官評價小組，以感官評分為指標，對不同輔料添加量的9組白芍花飲料進行感官評價。其中，產品感官評價標準分別從甜味、香味、澀味、酸味、外觀5個方面進行評分。提取物飲料調配感官評價標準見表3。

表3 提取物飲料的感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standards for extract beverage

1.4 數據處理

使用Excel 2016進行數據統計分析和圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 提取方式的選擇

提取方式對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖1。

圖1 提取方式對綜合評分的影響Fig.1 The effect of extraction method on the comprehensive score

由圖1可知，以加熱回流法提取方式綜合評分最高，溫浸法得分最低。但加熱回流法提取時間長，雜質溶出率高，靜置后沉淀多。而微波輔助提取利用被加熱物質的極性分子在電磁場中快速轉向及定向排列產生熱量，以達到提取效果[11]，其選擇性高、加熱迅速、滅菌能力強、安全無污染[12-13]，參照文獻[14-16]進行比較，并結合生產中的實際要求，最終確定采用微波輔助提取方式對白芍花進行提取。

十九大報告中明確提出“培養造就一支懂農業、愛農村、愛農民的‘三農’工作隊伍”［1］。基層農技人員隊伍是“三農”工作隊伍的重要組成部分，他們長期扎根基層、切實服務“三農”，是培育造就有文化、懂技術、會經營的新型職業農民，發展現代農業、實施鄉村振興戰略的重要力量。臺州科技職業學院作為浙江省九大現代農業技術培訓基地之一，承擔浙江省基層農技人員知識更新培訓任務。基于往年培訓中發現有基層農技人員在培訓課間流露對自身職業存在倦怠感的情況，而開始關注我省基層農技人員的職業狀態，并著手開展調研，探究其真實職業現狀、挖掘倦怠原因、有針對性地提出相關建議。

2.2 提取工藝單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數的確定

乙醇體積分數對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對綜合評分的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the comprehensive score

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，綜合評分逐漸升高，當體積分數達到70%時綜合評分達到最高值。可見在40%～70%范圍內，體積分數與綜合評分呈正相關。根據相似相溶原理，較高的乙醇體積分數有利于脂溶性的酚酸類、單萜類、黃酮類物質溶解，從而增加了綜合評分。同時考慮到過高的乙醇體積分數在進行微波輔助提取時會帶來安全隱患，所以未進行更高體積分數的試驗，因此選擇50%～70%進行正交試驗。

2.2.2 料液比的確定

料液比對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖3。

圖3 料液比對綜合評分的影響Fig.3 The effect of solid-to-liquid ratio on the comprehensive score

由圖 3 可知，料液比為 1∶15（g/mL）時綜合評分高于其它3組。原因可能是隨著溶劑體積增加，傳質推動力增大，活性成分的提取量會不斷增多[17]；料液比從1∶15（g/mL）增加至 1∶25（g/mL）時，綜合評分略有下降。因此正交試驗選擇 1∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）進行優化。

2.2.3 微波功率的確定

微波功率對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖4。

圖4 微波功率對綜合評分的影響Fig.4 The effect of microwave power on the comprehensive score

由圖4可知，綜合評分隨著微波功率的增大先升高后降低，功率為480 W時評分最高，但320、560 W與480 W評分差距不明顯。其原因是隨著微波功率增大產生的熱效應更強，但更高的功率也會增加影響綜合評分的負向成分的提取率，也會破壞部分活性成分的結構[18]。因此正交試驗選擇320 W～560 W進行優化。

提取次數對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖5。

由圖5可知，綜合評分隨著提取次數的增加而升高，且提取次數達到3次后，再增加提取次數對綜合評分影響較小，從生產工藝角度來說，更多的提取次數會增加生產成本以及時間，因此確定提取次數為3次。

圖5 提取次數對綜合評分的影響Fig.5 The effect of extraction times on the comprehensive score

2.2.5 提取時間的確定

提取時間對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖6。

圖6 提取時間對綜合評分的影響Fig.6 The effect of extraction time on the comprehensive score

由圖6可知，綜合評分隨著提取時間的增加先升高，在3 min時達到最大值，隨后呈現下降趨勢，原因可能是微波輔助提取時間過長產生的高溫會使以槲皮素為苷元的黃酮苷發生降解[19]，同時PF含有的苯甲酸酯鍵在有水的條件下受熱易分解或受其他成分的干擾[20]。因此正交試驗選擇2 min～4 min進行優化。

2.3 提取工藝正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以綜合評分為考核指標，按照L9（34）正交表進行試驗，每組試驗重復兩次，取其平均值，對亳州芍藥干燥花的提取工藝條件參數進行優化，其試驗結果見表4、表5。

表4 提取工藝優化正交試驗Table 4 Orthogonal test design for optimization of extraction process

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，亳州芍藥干燥花蕾提取中影響綜合評分主次順序為提取時間＞乙醇體積分數＞微波功率＞料液比；由正交試驗得出最優因素水平組合為A1B2C2D2，即提取時間 2min、微波功率 480W、料液比 1∶20（g/mL）、乙醇體積分數60%、提取3次。由方差分析結果可知，提取時間、微波功率、料液比、乙醇體積分數均對亳州芍藥干燥花蕾綜合評分影響顯著。

2.4 驗證試驗

按最優組合條件A1B2C2D2即正交試驗2號組，提取3次，測定其9種活性成分含量，并計算其綜合評分，結果分別為3.000 0、2.838 9、2.888 0，平均值為2.909 0，接近正交試驗最好值2.990，且相對標準偏差為2.84%，說明優化工藝穩定可行。

2.5 配方優化試驗

以感官評分為指標進行正交試驗，依據表2的感官評價標準對白芍花提取物飲料進行評分，其試驗結果見表6。

表6 配方優化正交試驗Table 6 Orthogonal test design for formula optimization

由表6可知，白芍花提取物飲料配方優化中影響感官評分主次順序為阿斯巴甜＞檸檬酸＞乙基麥芽酚；由正交試驗得出最優因素水平組合為a3b2c3，即阿斯巴甜含量0.032%、檸檬酸含量0.4%、乙基麥芽酚含量0.06%與正交優化結果一致。

3 結論

本研究通過單因素試驗和正交試驗，得出白芍提取物飲料的工藝參數和最適輔料添加量。采用微波輔助提取技術，最佳提取條件為微波功率480 W、乙醇體積分數 60%、料液比 1∶20（g/mL），提取時間 2 min，提取3次；將提取物溶液稀釋5倍，加入0.032%阿斯巴甜、0.4%檸檬酸、0.06%乙基麥芽酚，所制成的白芍花提取物飲料感官評分為78.0分，風味獨特，達到了預期的效果。