乳酸菌發酵鴨梨汁工藝優化及風味研究

李棟，牟德華，郭逸，王光亞

（河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018）

鴨梨富含糖、有機酸、維生素等營養物質，具有潤燥化痰、潤腸通便、養陰清熱、促進消化等功效[1-2]。乳酸菌在發酵過程中產生酸、多酚類物質等多種功效成分，其中乳酸具有調節胃腸道功能、提高免疫能力、抑制有害菌等作用[3-4]。乳酸菌發酵過程可以提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力，SOD 具有抗氧化作用。發酵后的鴨梨汁含酸量增加、并具有特有的乳酸菌代謝物質和風味特征[5-6]，更容易被人體吸收[7-9]。

周印等[10]以植物乳桿菌299、保加利亞乳桿菌717和嗜熱鏈球菌176混合發酵鴨梨汁，發酵后鴨梨汁口感突出，風味酸甜，發酵后有機酸含量提高。黃瀅潔等[11]以植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發酵鴨梨汁，優化了發酵鴨梨汁的生產工藝。Ankolekar等[12]利用嗜酸乳桿菌發酵鴨梨汁，通過體外試驗對發酵產物進行功能性研究。本研究以鴨梨為原料，自選戊糖片球菌與乳雙歧桿菌HN019按體積比1∶1混合作為發酵劑，進行鴨梨汁發酵工藝優化，并對產品的有機酸和揮發性香氣物質進行分析測定，以VC為參照，研究其體外抗氧化功能，為鴨梨開辟新的加工途徑和產品奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨梨：市售，河北省晉州地理標志保護產品，形態完好，無損傷。

乳酸菌：自選戊糖片球菌（Leuconostoc fallax，LF）分離自羊羔美酒大曲，Genbank登錄號KC454281；乳雙歧桿菌（Bifidobacterium）HN019（BF）：江蘇省江陰新申奧生物科技有限公司。

蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；牛肉膏（生化試劑）、MgSO4·7H2O（分析純）：天津市光復精細化工研究所；葡萄糖、過氧化氫（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑開發中心；CH3COONa·3H2O、水楊酸（均為分析純）：天津市標準科技有限公司；KH2PO4、MnSO4·H2O、無水乙醇（均為分析純）：天津市永大化學試劑廠；檸檬酸三銨（分析純）：天津市百世化工有限公司；吐溫80（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；NaOH（分析純）：天津市大陸化學試劑廠；2，2′-聯氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海寶曼生物科技有限公司；FeSO4（分析純）：天津市四通化工廠。

1.2 儀器與設備

DH300電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PL203電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Delta320型pH計：深圳市凱銘杰儀器設備有限公司；SW-CJ-1FDA超凈臺：北京華威中儀科技有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；7820-5975C氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀、HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國安捷倫公司；LC-20A高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本島津公司；ODSC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：迪馬科技有限公司；手動固相微萃取手柄、磁子及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷萃取頭：美國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

將鴨梨切塊榨汁，過濾殘渣，收集鴨梨汁。以發酵鴨梨汁中含酸量和SOD酶活力為考察指標，固定因素為菌液接種量（戊糖片球菌∶乳雙歧桿菌HN019=1∶1，體積比）3%、加糖量6%、32℃發酵3 d。考察菌液接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、加糖量（2%、4%、6%、8%、10%）、發酵時間（1、2、3、4、5 d）、發酵溫度（24、28、32、36、40℃）對含酸量和SOD酶活力的影響。

1.3.2 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面試驗設計[13-15]，以發酵鴨梨汁含酸量與SOD酶活力為響應值，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.3 理化指標測定

含酸量參考GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》[16]中方法測定。

SOD酶活力參考GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》[17]中方法測定。

1.3.4 有機酸的測定

1.3.4.1 標準品的制備

分別配制單標原液，濃度為草酸5g/L、酒石酸25g/L、DL-蘋果酸60 g/L、檸檬酸50 g/L、丙酮酸40 g/L、乳酸600 g/L、乙酸700 g/L、琥珀酸50 g/L。乳酸、乙酸各取0.1mL，琥珀酸取2 mL，其余5種有機酸各取1 mL混合，用水定容至10mL，所得溶液為有機酸混標溶液。

1.3.4.2 樣品預處理

將樣品以4 000 r/min，離心10 min，0.45 μm微孔濾膜過濾上清液2次。

1.3.4.3 測定條件

流動相A：pH=2.9，0.02 mol/L磷酸二氫銨；流動相B：100%乙睛。A∶B=98∶2（體積比），流速 0.5 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL，于213 nm檢測。梯度洗脫程序為 0～15.02 min，98%～98.2%A、2%～1.98%B；15.02 min～22.50 min，98%A、2%B。

1.3.5 頂空固相微萃取測定揮發性香氣物質

1.3.5.1 揮發性香氣物質的萃取

揮發性香氣物質萃取采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HP-SPME）法[18]提取發酵鴨梨汁中的揮發性香氣物質。取5 mL試樣，加入2 g干燥的NaCl，密封置于50℃水浴中平衡15 min。推手柄使纖維頭伸出針管萃取吸附30 min，取出手柄直接進樣，250℃下解吸3 min。

1.3.5.2 揮發性香氣物質的測定

色譜條件[19-20]：載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；升溫程序：40℃保持12 min，以3℃/min升至108℃保持2 min，再以5℃/min升至250℃保持5 min，進樣口溫度250℃。質譜條件：離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電離方式為EI，電子能量70 ev；掃描質量范圍為 45 amu～550 amu。

1.3.5.3 揮發性香氣物質定性與定量

定性分析：采用氣相色譜質譜聯用儀自帶質譜數據庫，并通過檢索和查閱相關文獻作為參考[21]。

定量分析：采用內標法，內標物為2-辛醇（389mg/L），計算公式如下。

式中：W為揮發性風味化合物質量濃度，mg/L；F為加入內標物質量，mg；A為待測組分的峰面積；B為內標物的峰面積；G為待測組分對內標物的質量相對校正因子。

1.3.6 發酵鴨梨汁抗氧化性的測定

1.3.6.1 VC濃度的配制

配制濃度為1.4 mg/L VC，將其稀釋成0.1 mg/mL～1.4 mg/mL。分別與 DPPH·、ABTS+·、羥基自由基清除率作對照。

1.3.6.2 鴨梨汁樣品處理

各稱取160 mg發酵前、后的鴨梨汁，用去離子水定容到10 mL，配成濃度為16 mg/mL的鴨梨汁，稀釋成2 mg/mL～16 mg/mL用于試驗操作。

1.3.6.3 抗氧化試驗

根據孫鵬堯[22]的方法，測定DPPH自由基和ABTS+自由基清除率。根據韓秋菊等[23]的方法，測定羥基自由基清除率。

1.3.7 感官評價

由10名受過訓練的老師和學生組成感官評定小組，從色澤、組織狀態、氣味、滋味、口感5個方面對發酵前后的鴨梨汁進行感官評價，評分標準如表2所示。

表2 鴨梨汁感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards for pear juice

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，用Origin 8.0作圖，使用SPSS 19.0進行數據顯著水平分析，p＜0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵鴨梨汁單因素試驗結果

2.1.1 接種量對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響

接種量對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響見圖1。

圖1 接種量對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響Fig.1 The effect of inoculum on acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由圖1可知，當接種量1%～3%時，發酵鴨梨汁里的含酸量和SOD酶活力逐漸增大，原因可能是隨著接種量增加，乳酸菌將鴨梨汁中的營養成分轉換成酸，提高了發酵鴨梨汁的含酸量和SOD酶活力；當接種量為3%時，發酵鴨梨汁中的含酸量和SOD酶活力達到最大，分別為6.21 g/kg和375.68 U/mL；當接種量超過3%時，含酸量和SOD酶活力下降，可能是因為菌量過高，營養物質消耗殆盡，導致發酵鴨梨汁中的含酸量和SOD酶活力下降。因此，選取接種量為2%、3%、4%進行響應面試驗設計。

2.1.2 加糖量對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響

加糖量對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響見圖2。

圖2 加糖量對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響Fig.2 The effect of the amount of sugar added on the acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由圖2可知，隨著加糖量的增加，發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力均呈先上升后下降的趨勢。加糖量為6%時，含酸量和SOD酶活力達到高峰，加糖量繼續增加，發酵鴨梨汁含酸量與SOD酶活力逐漸下降，原因可能是高濃度糖分抑制乳酸菌。因此，選取加糖量為4%、6%、8%進行響應面試驗設計。

2.1.3 發酵時間對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響

發酵時間對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響見圖3。

圖3 發酵時間對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響Fig.3 The effect of fermentation time on the acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由圖3可知，當發酵3 d時，發酵鴨梨汁發酵含酸量和SOD酶活力達到最大值，繼續延長發酵時間，其含酸量和SOD酶活力下降，可能是發酵鴨梨汁中的營養物質被消耗導致乳酸菌活力下降，間接影響鴨梨汁中含酸量和SOD酶活力。因此，選取發酵時間為2、3、4 d進行響應面試驗設計。

2.1.4 發酵溫度對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響

發酵溫度對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對發酵鴨梨汁含酸量和SOD酶活力的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature on the acid production and SOD enzyme activity of fermented pear juice

由圖4可知，在24℃～36℃時，發酵鴨梨汁含酸量隨發酵溫度的升高而增大，發酵溫度為36℃時，含酸量達到最大值。在24℃～32℃時，發酵鴨梨汁的SOD酶活力隨發酵溫度的升高而增大。發酵溫度為32℃時，SOD酶活力達到最高峰；SOD酶活力在32℃和36℃相差不大，因此選取發酵溫度為28、32、36℃進行響應面試驗設計。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

以接種量、加糖量、發酵時間、發酵溫度為因素，含酸量和SOD酶活力為響應值進行發酵鴨梨汁優化試驗。響應面Box-Behnken試驗設計及結果見表3。

表3 響應面Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Response surface Box-Behnken test design and results

利用Design Expert 8.0.6軟件分析得到含酸量（X1）和 SOD 酶活力（X2）對自變量 A（接種量）、B（加糖量）、C（發酵時間）、D（發酵溫度）的回歸方程如下。

X1=6.30-0.028A+0.14B-0.16C-0.14D+0.063AB-0.058AC-0.04AD-0.32BC+0.32BD-0.11CD-0.16A2-0.47B2-0.22C2-0.89D2。

X2=343.93+0.27A-2.91B-3.38C-3.53D+12.73AB-21.84AC+2.17AD+10.05BC-8.27BD-7.6CD-6A2-29.06B2-14.75C2-29.88D2。

含酸量和SOD酶活力方差分析見表4和表5。

表4 含酸量方差分析Table 4 Variance analysis of acid production

表5 SOD酶活力方差分析Table 5 Analysis of variance of SOD enzyme activity

由表4和表5可知，兩個模型均達顯著水平（P＜0.05），且失擬項不顯著（P＞0.05），表明方程與實際數據擬合性良好，試驗設計可靠，適用于發酵鴨梨汁工藝參數的優化。在方差分析表中用F值來衡量該因素對含酸量和SOD酶活力的影響，F值越大其影響程度也越明顯，P值越小其影響程度越明顯。影響發酵鴨梨汁含酸量的因子主次順序為發酵溫度＞發酵時間＞加糖量＞接種量，且 B2對模型影響顯著（P＜0.05），D2對模型影響極顯著（P＜0.01）。影響發酵鴨梨汁SOD酶活力的因子主次順序為發酵時間＞發酵溫度＞加糖量＞接種量，且 AC、B2、D2對模型影響顯著（P＜0.05）。

2.2.2 因素交互分析

各因素交互分析結果見圖5和圖6。

圖5 各因素交互作用對含酸量的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors on acid production

圖6 各因素交互作用對SOD酶活力的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the interaction of various factors on SOD enzyme activity

由圖5可知，A與D、B與C、B與D、C與D交互作用的三維圖較陡，曲面變化較為明顯，等高線圖呈橢圓形，說明A與D交互作用、B與C交互作用、B與D交互作用和C與D交互作用對發酵鴨梨汁的含酸量影響較大。A與B交互作用三維圖坡面較陡，但變化不顯著，故加糖量與接種量的交互作用對發酵鴨梨汁含酸量的影響并不明顯。

由圖6可知，B與D交互作用的三維圖較陡，曲面變化較為明顯，等高線圖呈橢圓形，說明B與D交互作用對發酵鴨梨汁SOD酶活力的影響較大。發酵時間的曲線變化幅度較大，說明該因素對發酵鴨梨汁SOD酶活力的影響較大；A與C交互作用三維圖坡面較陡，但變化不顯著，故發酵溫度與接種量的交互作用對發酵鴨梨汁SOD酶活力的影響并不明顯。

2.2.3 驗證試驗

通過響應面設計試驗結果分析，鴨梨汁發酵最佳工藝條件為接種量3.46%、加糖量6.23%、發酵溫度30.21℃、發酵時間2.98 d，含酸量和SOD酶活力分別達到6.32g/kg和345.3U/mL。考慮到實際操作，將優化后的發酵條件修正為接種量3.5%、加糖量6%、發酵溫度30℃、發酵時間3d，試驗結果得到含酸量為6.35g/kg，SOD酶活力為345.65 U/mL。與預測值相近，表明試驗結果與該模型擬合度較好。因此，通過響應面分析法優化得到的酸菌發酵鴨梨工藝條件準確可靠，參考性較高。

2.3 發酵鴨梨汁有機酸成分分析

發酵鴨梨汁有機酸成分分析結果見表6。

有機酸可以維持人體正常的生理活動，具有修復人體病變器官的效果等[24-30]。由表6可知，發酵前鴨梨汁的有機酸主要以檸檬酸為主，占總酸51.1%，發酵后主要是乳酸和乙酸，從發酵前占總酸含量的12.6%和12.1%提高到41.2%和40.6%。乳酸的變化與潘勇等[31]的研究結果一致，發酵過程中乳酸菌將大量的檸檬酸轉變成乳酸和乙酸。

表6 有機酸含量測定結果Table 6 Results of determination of organic acid content before and after fermentation

2.4 發酵鴨梨汁揮發性香氣物質分析

發酵鴨梨汁揮發性香氣物質分析結果見表7。

表7 發酵鴨梨汁揮發性香氣物質分析Table 7 Analysis of volatile aroma substances in fermented pear juice

續表7 發酵鴨梨汁揮發性香氣物質分析Continue table 7 Analysis of volatile aroma substances in fermented pear juice

由表7可知，發酵后揮發性香氣物質種類和數量均明顯增加，主要揮發性香氣物質種類由17種增加到28種，含量提高8.5倍。以醇類物質含量變化最大，由0.72 μg/L增加到62.80 μg/L，苯乙醇含量最高，達到33.57 μg/L。其次是酯類物質含量發酵后較發酵前有所增加，且多數酯類具有花果香氣，極大地增加了發酵后鴨梨汁獨特的風味，如癸酸乙酯，其具有梨和白蘭地的香韻[32]，含量最大達19.88 μg/L；辛酸乙酯具有令人愉快的花果香氣、杏子香氣[33]；乙酸苯乙酯具有令人愉悅的花香[34]。酚類物質總量由0.54 μg/L增加至2.19 μg/L，酚類物質提高了發酵鴨梨汁的抗氧化性。

2.5 體外抗氧化性結果分析

2.5.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定結果見7。

由圖7可知，以VC為參照，隨著VC濃度的增加DPPH自由基清除率提高，發酵鴨梨汁濃度達到12 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到最高值，與VC的DPPH自由基清除率最高值接近，達到80.46%，相對于鴨梨汁提高26.63%。可見鴨梨汁經過乳酸菌發酵，分解鴨梨汁中的營養成分，促使酚類物質含量上升，提高了DPPH自由基清除率。

圖7 VC與樣品DPPH自由基清除率Fig.7 Vitamin C and DPPH scavenging ability of the sample

2.5.2 ABTS+自由基清除率的測定

ABTS+自由基清除率的測定結果見圖8。

圖8 VC與樣品的ABTS+自由基清除率Fig.8 Vitamin C and the ABTS+scavenging ability of the sample

由圖8可知，以VC為參照，VC濃度0.6 mg/mL時的ABTS+自由基清除率為85.53%。發酵鴨梨汁濃度為12 mg/mL時，ABTS+自由基清除率達到78.71%，濃度為12 mg/mL的鴨梨汁ABTS+自由基清除率為60.35%。可知發酵鴨梨汁比鴨梨汁的ABTS+自由基清除率提高了17.18%。

2.5.3 羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定結果見圖9。

圖9 VC與樣品的羥自由基清除率Fig.9 Vitamin C and the hydroxyl radical scavenging ability of the sample

由圖9可知，發酵鴨梨汁在不同濃度下羥基自由基清除率均高于鴨梨汁，說明在發酵過程中，乳酸菌提高了鴨梨汁的羥基自由基清除率。以VC為參照，0.35 mg/mL的VC羥基自由基清除率為80.34%，發酵鴨梨汁濃度為14 mg/mL，羥基自由基清除率達到最高值72.63%，與發酵前的60.35%相比有明顯的提高。

2.6 感官評價結果

發酵鴨梨汁經品嘗綜合得分為81.5分，較發酵前的鴨梨汁高10.5分。感官評價結果雷達圖見圖10。

由圖10可知，發酵鴨梨汁在色澤、氣味、滋味和口感方面均比未發酵的鴨梨汁得分高，發酵后鴨梨汁的色澤呈禾桿黃色，具有濃郁的果香和發酵香，滋味協調，風味突出，并具有鴨梨發酵特有的口感，酸甜適度。各項理化指標符合QB/T5356—2018《果蔬發酵汁》要求。

圖10 發酵前后鴨梨汁的感官評價雷達圖Fig.10 Sensory evaluation radar chart of pear juice before and after fermentation

3 結論

在單因素試驗基礎上進行了Box-Behnken優化試驗，得到混合菌發酵鴨梨汁最佳工藝條件為混合乳酸菌接種量3.5%、加糖量6%、30℃發酵3 d，發酵鴨梨汁含酸量6.35 g/kg，SOD酶活力345.65 U/mL，以乳酸和乙酸為主體有機酸和以苯乙醇、異戊醇和葵酸乙酯為主體揮發性香氣物質。DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基清除率最高分別達到80.46%、78.71%和72.63%。為鴨梨深加工和工業開發奠定了基礎。