固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂膠中氯霉素殘留

王玉涵，王欣然，陸超麗，吳殿軍，周金慧，3，4*，李熠

（1.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.昭平縣農村社會事業促進站，廣西 賀州 546800；3.農業農村部蜂產品質量安全控制重點實驗室，北京 100093；4.農業農村部蜂產品質量安全風險評估實驗室，北京 100093；5.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

蜂膠，是蜜蜂采集膠源植物（楊樹、樺樹、桉樹、酒神菊類植物、血桐屬植物、黃檀屬植物）樹脂等分泌物后與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質，被蜜蜂用來修補蜂箱的縫隙、加固以及清潔蜂巢[1-2]。蜂膠組成復雜，主要包括樹脂（55%）、蜂蠟（30%）、揮發性油（10%）以及蜂花粉（5%）等組分，已知成分達420余種，其中包含多達70余種的黃酮化合物以及其他活性物質，豐富的活性成分賦予了蜂膠抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等生物活性，使其具有增強機體免疫力和預防疾病等功效[3-5]。蜜蜂在生存環境條件惡劣以及自身免疫力較低時，容易受到病菌的侵害，導致蜂群感染歐洲幼蟲腐臭病等細菌性疾病，蜂農常用抗菌性藥物來防治這類蜜蜂疾病，其中包括具有廣譜抗菌性且價格低廉的氯霉素[6]。然而藥物的不規范使用會導致藥物在蜂群中殘留進而污染蜂產品。已有相關研究表明氯霉素可導致再生障礙性貧血和灰嬰綜合征[7]，但目前尚無明確的劑量-效應作用[8]。目前很多國家已禁止在食用性動物中使用氯霉素藥物，許多國家均規定氯霉素在動物源性食品中不得檢出[9-11]。然而蜂膠中氯霉素殘留檢測的相關標準尚不完善，為保障蜂膠產品的質量安全，需建立對蜂膠中氯霉素藥物殘留可靠有效的檢測方法。

目前為止，畜禽肉類、水產品、牛奶以及蜂蜜[8，12-14]等食品中氯霉素殘留檢測方法已多見報道，氯霉素的檢測手段主要包括酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[15]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[16]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[17]以及高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）[18]，還包括酶生物傳感器[19]和鎢酸鋅納米電化學傳感器[20]等新型檢測方法。其中HPLC-MS/MS具有高靈敏度和穩定性，常與液-液萃取[21]和基體分散固相萃取（matrix solid-phase dispersion，MSPD）[14]等技術相結合，被廣泛應用于食品中藥物殘留檢測，實現對目標分析物的準確定量[22]。目前，對蜂膠中氯霉素提取多采用液-液萃取法，使用大量的對環境和人體健康不利的有機試劑如乙酸鉛、甲基叔丁基醚、正己烷等[5，18，21，23]。此外，此類研究定量線性范圍有限，未涵蓋50 μg/L以上的較高濃度范圍。因此，建立一種快捷、高效、綠色環保，同時可實現蜂膠中不同濃度氯霉素殘留的準確定量的檢測方法是十分必要的。

本研究通過HPLC-MS/MS法進行定性、定量分析測定蜂膠中氯霉素藥物殘留。考察不同提取溶劑、固相萃取柱等因素對蜂膠中殘留氯霉素的提取、凈化效率的影響。并對色譜和質譜條件進行優化，達到分析目標物所需的靈敏度和穩定性。因此本研究可為監控蜂膠質量安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠樣品：市售；氯霉素（純度98%）、氯霉素-D5（純度98%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；氯化鈉、氫氧化鈣（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Bond Elut Plexa 固相萃取柱（200 mg，6 mL）：美國 Agilent公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290 HPLC高效液相色譜儀、6495三重四極桿串聯質譜儀（配電噴霧電離源）：美國Agilent公司；G560E渦動儀：美國Scientific Industries公司；1-15PK離心機：美國Sigma有限公司；Milli-Q純水發生器：美國Millipore公司；BSA124S電子天平：德國賽多利斯有限公司；Kinetex C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）：美國 Phenomenex公司。

1.3 標準溶液制備

準確稱取氯霉素標準品及其內標氯霉素-D5標準品各10 mg，用甲醇溶解配制成1 000 mg/L的標準儲備液，于-20℃棕色瓶中避光保存；用乙腈將氯霉素-D5標準儲備液稀釋為1 mg/L的標準使用液；將氯霉素標準儲備液稀釋制備濃度為 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/L，內標質量濃度為 50 μg/L 系列標準工作溶液，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品制備

在溫度高于25℃的條件下，蜂膠呈黏性膠質狀態，將樣品置于-20℃條件下冷凍2 h，取出冷凍樣品立即用粉碎機制備蜂膠均勻粉末。

1.4.2 提取

稱取蜂膠粉末0.25 g于50 mL離心管中，加入25 μL濃度為100 ng/mL的氯霉素-D5標準溶液，渦旋混勻。加入5 mL乙腈，渦旋至蜂膠完全溶解，加入5 mL 0.5%Ca（OH）2溶液，渦旋混勻，再加入 1 g NaCl，漩渦振蕩2 min，于4℃下8 000 r/min離心10 min，取出上層清液，在40℃下氮吹至近干，加入10 mL 10%甲醇復溶，4℃下8 000 r/min離心10 min，保留上層清液，下層沉淀中加入10 mL 10%甲醇溶解，重復提取一次，將兩次上清液合并，待固相萃取柱凈化。

1.4.3 凈化

Bond Elut Plexa固相萃取柱（6 mL，200 mg）使用前依次用10 mL甲醇和10 mL水活化，將1.4.2節中上清液轉移至已活化的Bond Elut Plexa固相萃取柱中，調節流速以≤3 mL/min通過固相萃取柱。待上清液完全流出后，10 mL水淋洗，棄去流出液，負壓抽干。10 mL甲醇洗脫，洗脫液收集于15 mL離心管中，于40℃下氮吹至近干，1 mL 10%乙腈水復溶，4℃下14 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜條件

流動相 A：水；流動相 B：乙腈。梯度洗脫：0～2 min，10%B；2 min～4 min，30%B；4 min～4.1 min，75%B；4.1 min～5.1 min，100%B；5.1 min～6.5 min 10%B。流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.6 質譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）；負離子模式；掃描方式：多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓：2 500 V；干燥氣溫度：270℃；干燥氣流速：11L/min；霧化器壓力：275.8kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；噴嘴電壓：0 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件

氯霉素在負離子模式下可獲得穩定的分子離子[M-H]-。本試驗中分別將1.0 mg/L的氯霉素標準溶液和1.0 mg/L的氯霉素-D5標準溶液注入電噴霧離子源，在負離子（ESI-）全掃描模式下獲得氯霉素和氯霉素-D5的分子離子[M-H]-。然后在碎片離子掃描模式下得到氯霉素和氯霉素-D5的子離子信息。最后通過多反應監測（MRM）掃描模式對各子離子碰撞能進行優化，獲得氯霉素和氯霉素-D5的最佳質譜參數，質譜選擇離子參數見表1。

表1 質譜選擇離子參數Table 1 Transitions and optimal conditions used for MS/MS analysis

2.2 色譜條件確定

本研究考察了甲醇/水和乙腈/水兩種不同的流動相體系，由于乙腈的極性比甲醇弱，它更能有效地洗脫弱極性的氯霉素，縮短氯霉素在色譜柱中的保留時間，同時在乙腈/水體系中干擾峰少，且氯霉素獲得了較高的質譜響應。通過調整流動相洗脫比例，可使目標分析物盡可能遠離雜質干擾峰產生的離子抑制區域，以降低基質影響并提高目標分析物的質譜響應[24-25]。本研究中發現當乙腈比例快速增加時，可縮短目標分析物的保留時間并獲得更高的信號響應。色譜柱的溫度也會影響分析時間和目標物的分離效果，為了在合適的分析時間內完成目標物的有效分離，對不同柱溫（30、35、40℃）進行了測試和比較。結果表明，目標分析物在柱溫為40℃時分離效果最佳。因此，本研究中采用乙腈/水作為流動相，40℃柱溫，經優化的色譜柱流動相梯度洗脫，在6.5 min（含清洗和平衡時間）的分離時間內，可實現良好的色譜分離并獲得較高的質譜響應。

經優化的質譜和液相色譜條件下空白蜂膠基質、加標基質（2.0 μg/kg）以及氯霉素標準溶液（0.5 μg/L）的MRM色譜圖見圖1。

圖1 MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms

2.3 樣品前處理方法優化

2.3.1 提取條件優化

氯霉素的油水分配系數對數值為1.02，是偏親脂性物質，可溶于有機溶劑，微溶于水。本研究中考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈以及甲苯/水溶液對蜂膠中氯霉素的提取效果，結果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑提取蜂膠中氯霉素的絕對回收率Fig.2 Absolute recoveries of chloramphenicol inpropolis using different extraction solutions

由圖2可知，乙酸乙酯作提取劑時氯霉素的絕對回收率最高，但乙酸乙酯作提取溶劑時提取溶液渾濁，由于蜂膠中含有較多的脂溶性成分，因此在乙酸乙酯共同提取物中存在了較多脂溶性雜質（樹脂、蜂蠟以及黃酮類化合物[26]，這些共同提取物產生的雜質干擾峰影響目標物在質譜中的響應，不利于后續的分析測定。以甲醇∶水（體積比3∶7）作提取劑時，氯霉素絕對回收率為38%；當乙腈作為提取劑時，絕對回收率為59%，乙腈提取物相比于乙酸乙酯提取物澄清，且乙腈提取物的色譜圖中雜質峰與目標分析物分離度高，基質干擾較小，利于低濃度目標物的篩查測定。當甲苯/水體系作為提取劑時，由于蜂膠可溶于甲苯，而氯霉素不溶于甲苯但可微溶于水，使得蜂膠基質中的脂溶性物質萃取到甲苯層而氯霉素萃取到水層，進而實現氯霉素與蜂膠基質中親脂性雜質干擾物的分離。同時，不同比例的甲苯/水體系可導致提取效果有所差異，本研究測試了不同比例的甲苯∶水（體積比 7∶3、6∶4、5∶5、4∶6）的提取效果，其中甲苯∶水體積比為 6∶4 時可獲得較高的絕對回收率（51.68%）；甲苯∶水體積比 5∶5、4∶6時絕對回收率均近似為45%；甲苯∶水體積比為7∶3時，甲苯/水的萃取回收率最低，僅為41.57%。同時發現隨著甲苯比例的增加，萃取過程發生了乳化，因此過高的甲苯比例不利于目標分析物的萃取分離。由以上結果表明，乙腈和甲苯∶水（體積比6∶4）作為提取溶劑時氯霉素的絕對回收率較高，同時共同提取物干擾少，有利于后續分析測定。由于甲苯的毒性較大且使用時危險性較高，因此，最終選用乙腈作為提取劑。

為除去乙腈提取物中的雜質干擾，需對提取物進行除雜處理。本研究中分別測試了不同濃度的堿性溶液[Ca（OH）2溶液、NaOH 溶液]、酸性溶液（三氯乙酸）以及酸堿復合溶液的除雜效果，結果如圖3所示。

圖3 不同除雜溶液作用下蜂膠中氯霉素絕對回收率Fig.3 Absolute recoveries of chloramphenicol inpropolis using different solutions to remove impurities

由圖3可知，采用1%NaOH溶液聯合5%三氯乙酸除雜所獲得絕對回收率最差（3%），由于黃酮類化合物可溶于堿性溶液，同時在酸性溶液中沉淀析出[27]，在乙腈提取物中先后加入1%NaOH溶液和5%三氯乙酸溶液，出現了大量懸浮的絮狀物，由于絮狀物可能包裹目標分析物導致回收率變差；5%三氯乙酸除雜所獲得絕對回收率為20%，由于氯霉素在酸性環境中易形成離子態，使得目標分析物的極性增大，難以被有機溶劑提取；1%NaOH溶液絕對回收率（58%）與0.5%Ca（OH）2溶液接近，當NaOH溶液與乙腈提取物混合時，同樣出現明顯絮凝現象，同時絮凝物與液體分層不明顯。濃度為0.5%的Ca（OH）2溶液絕對回收率最高（66.8%），且絮凝物在靜置3 min后可聚集并下沉到下層。本研究結果與楊黎等[28]的研究結果一致，0.5%Ca（OH）2溶液可用于去除乙腈蜂膠提取物中的親脂性物質。

為促進液液萃取時雜質萃取層與目標分析物萃取層的分離，參考Koltsakidou等[29]的研究，在乙腈提取物與0.5%Ca（OH）2溶液混合體系中加入NaCl以促進兩相分層。最后，在固相萃取柱凈化前，需將樣品溶液的溶劑體系轉化為高比例水相體系，由于10%甲醇可以溶解氯霉素，同時不會破壞固相萃取柱的填料結構，因此，本研究采用10%甲醇對氮吹后的濃縮提取物進行復溶。

2.3.2 固相萃取小柱的選擇及凈化條件優化

經純化的乙腈提取物呈淡黃色，表明其中黃酮類化合物未被完全除去。為進一步凈化和保留富集乙腈提取物中的氯霉素，本研究比較了混合型陽離子交換固相萃取柱（PCX）、親水親脂型反相固相萃取柱（Oasis HLB）以及非極性保留固相萃取柱（Bond Elut Plexa）的凈化效果。PCX和Oasis HLB固相萃取柱對添加氯霉素濃度水平為40 μg/kg的蜂膠基質進行富集凈化，Bond Elut Plexa對添加氯霉素濃度水平為4 μg/kg的蜂膠基質進行富集凈化，添加氯霉素的蜂膠基質經不同固相萃取柱凈化后獲得MRM色譜圖如圖4所示。

圖4 不同固相萃取柱凈化蜂膠中氯霉素的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of residual chloramphenicol in propolis under different solid-phase extraction cartridges

由圖4可知，Oasis HLB柱相比于PCX柱，其對目標物的凈化效果更好，可獲得較高的目標物質譜信號響應，但其對添加濃度水平為4 μg/kg的提取物的凈化富集效果不佳。為凈化低添加濃度水平的提取物，本研究中考察了Bond Elut Plexa柱的凈化能力，由于Bond Elut Plexa柱是以表面含羥基配體的親水苯乙烯-二乙烯苯聚合物為填料[30]，因此，能夠保留具有羥基結構的氯霉素同時還能去除脂類雜質。由圖4中Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化加標提取物中氯霉素的MRM色譜圖可知，Bond Elut Plexa對基質凈化效果明顯，降低了雜質干擾并獲得了較高的信號響應。在整個提取、除雜以及凈化過程中都使用了與氯霉素結構和化學性質相似的同位素內標物氯霉素-D5，以校正分析物在前處理過程中的質量損失，在最佳提取和凈化條件下，獲得了90%以上的相對回收率。

2.4 方法驗證

2.4.1 方法線性關系

用乙腈溶劑配制濃度為 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/L，內標物氯霉素-D5 濃度均為2.5 μg/L的系列標準工作液，在優化后的質譜和色譜條件下進行測定。以所對應的氯霉素標準溶液濃度為橫坐標（X），各濃度下氯霉素色譜峰面積平均值為縱坐標（Y），外標法線性回歸方程為Y=31 177X+105 316（R2=0.998 5）；以氯霉素標準溶液濃度為橫坐標（X），各濃度下氯霉素色譜峰面積與氯霉素-D5色譜峰面積比值的平均值為縱坐標（Y），內標法的線性回歸方程為 Y=0.413 2X-1.237 9（R2=0.999 2）。綜上，采用同位素內標校正，線性相關系數和回收率均優于外標法，因此，本研究采用內標法定量，氯霉素在0.1 μg/L～500.0 μg/L濃度范圍內，其濃度與對應的其定量離子峰面積比值呈良好線性關系，線性相關系數大于0.99，滿足殘留分析的要求。

2.4.2 基質效應評價

由于基質中存在共提取物，會增強或抑制待測目標物的信號響應，影響分析結果的準確性。為對目標物進行準確定量，需對樣品的基質效應進行評估。由1.4節前處理操作制備得到含內標物的空白基質液，在0.1 μg/L～500.0 μg/L濃度范圍內配制與上述含內標物的系列標準工作液濃度相同的系列基質標準工作液，并計算出含內標物的樣品基質匹配標準曲線方程Y=733.36X+2 166.8（R2=0.999 0）。基質效應計算公式為B/A×100（A為含內標物的溶劑標準校準曲線的斜率；B為含內標物的基質匹配標準曲線的斜率），當基質效應在80%到120%之間被認為是可被接受的低基質效應，小于80%被認為存在基質抑制效應；大于120%被判定為存在基質增強效應[31]。結果表明，經內標物校正的基質效應為85.16%，基質抑制效應低于20%，因此本試驗中可采用含內標物的溶劑配制標準工作曲線溶液進行定量分析。

2.4.3 方法檢出限

按2.4.2方法得到含內標物的空白基質液，添加系列濃度的氯霉素標準溶液并進行測定分析，根據6個空白樣品中基線噪音的平均值，以3倍信噪比（S/N=3）計算得到該方法檢測限；以10倍信噪比（S/N=10）計算得到該方法定量限。經測定本方法檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別為 0.4 μg/kg 和 1 μg/kg。

2.4.4 方法加標回收率和精密度

在含內標物的空白蜂膠樣品中分別添加1、2、10 μg/kg 3個同濃度水平，每個水平設5個平行，設置一組空白對照。計算得到回收率及精密度，測定結果見表2。

表2 方法回收率、精密度、檢測限和定量限（n=5）Table 2 Recovery，precision，LOD and LOQ of CAP in blank propolis samples（n=5）

蜂膠樣品中氯霉素在3個添加濃度的回收率在93.25%～103.41%之間。日內相對標準偏差在0.98%～3.95%；日間相對標準偏差在0.93%～5.37%。由回收率和精密度可見，該方法準確性、穩定性良好，可滿足殘留檢測的要求。

2.5 實際樣品測定

采用本文所建立的方法測定2019年不同蜂場、蜂產品公司和超市的26份蜂膠樣品。測定結果顯示，15.38%的蜂膠樣品檢出氯霉素，其濃度在1.06 μg/kg～130.62 μg/kg之間。表明目前我國養蜂業中存在違規使用氯霉素的情況，因此，需加強對養蜂業中氯霉素藥物的監督管理。

3 結論

本研究建立了固相萃取結合高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂膠中氯霉素殘留的定性篩查與定量分析方法。經優化的前處理方法便捷、高效，經乙腈提取，經Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化蜂膠基質，可實現蜂膠中氯霉素殘留物的有效提取與富集凈化。該方法的準確度、精密度和靈敏度均經過方法學評價，滿足殘留檢測的要求，本方法可用于準確檢測蜂膠中氯霉素殘留水平。