基于網絡藥理學探究黃芪-白術藥對治療骨質疏松性骨折的作用機制

毛銀楓,崔松香,華臻,彭竑程,王建偉

(1.南京中醫藥大學研究生院,江蘇 南京210023；2.南京中醫藥大學無錫附屬醫院骨傷科,江蘇 無錫 214072)

骨質疏松癥是一種以骨量低和骨組織的微細結構退化為特征的全身骨骼疾病,研究顯示,我國骨質疏松的患病率為6.6%～19.3%[1]。骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)是由骨質疏松癥導致的骨折,常見于55歲以上的女性和 60歲以上男性,易導致大量與骨骼相關的疾病,并增加患者死亡率和醫療費用[2]。中醫藥防治OPF具有獨特優勢[3-4],從脾論治已廣泛應用于臨床,但缺少確切機制研究以闡明其科學性。本研究選取健脾的常用藥對黃芪-白術作為研究對象,探討其治療OPF的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 篩選黃芪-白術藥對活性成分

使用TCMSP數據庫[5](https://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以“黃芪”“白術”為檢索詞,檢索藥對的全部活性成分數據,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件[6],篩選出藥對活性成分及其對應靶點。

1.2 篩選OPF疾病靶點

分別檢索GeneCards(https://www.genecards.org/),OMIM(http://www.omim.org/),TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)數據庫,檢索詞為“osteoporotic fracture”,合并后刪除重復條目,以獲得目前已知的與OPF相關的人類靶點。

1.3 構建蛋白質相互作用(PPI)網絡及篩選關鍵靶點

應用R語言篩選藥對靶點和OPF靶點的交集,使用String數據庫(https://string-db.org/)上傳交集靶點,并進一步篩選關鍵靶點。

1.4 構建藥對-有效成分-靶點-疾病網絡

使用Cytoscape 3.7.1,將篩選的靶點導入軟件,繪制藥對有效成分作用于OPF相關靶點的網絡關系圖。

1.5 富集分析

利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進一步分析關鍵靶點蛋白在基因功能中的作用,對關鍵靶點進行GO生物學過程與KEGG代謝通路富集分析,并將富集分析結果以氣泡圖的形式展示。其中,不同類型富集結果以不同顏色節點表示,氣泡大小表示富集程度是否顯著。以P<0.05為差異有統計學意義[7]。

1.6 分子對接驗證

取“藥對-活性成分-靶點-OPF”網絡度值排名前6的活性成分及PPI網絡度值排名前5的靶點蛋白進行分子對接驗證。大蛋白受體3D結構從PDB數據庫下載,小分子配體從TCMSP數據庫獲得,然后使用PyMOL軟件對關鍵靶點蛋白進行去水、加氫等操作,分子對接通過AutoDockTools 1.5.6、AutoDock Vina軟件實現,結合能記錄在Excel表格中。

2 結果

2.1 篩選藥物成分及其靶點

通過TCMSP數據庫篩選黃芪-白術所有成分68個,以OB≥30%,DL≥0.18為篩選條件,共篩選出有效成分19個,主要為葡萄糖苷、常春藤素、異鼠李素、槲皮素、芒柄花素、山奈酚等,相對應的作用靶點176個,主要為前列腺素內過氧化物合酶2、前列腺素內過氧化物合酶1、誘導型氧化亞氮合酶、轉錄因子AP-1(JUN)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)等。

2.2 篩選OPF相關靶點

通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數據庫,檢出OPF已知的人類相關靶點分別為2 903個、64個、0個,合并、刪除重復數據后,共納入2 953個OPF相關靶點。

2.3 構建PPI網絡及分析

運用R語言VennDiagram數據包篩選出黃芪-白術藥對有效成分對應的靶點和OPF相關靶點的交集靶點,由此篩選出115個交集核心靶點。將靶點導入String數據庫平臺預測蛋白相互作用關系,結果以TSV格式導出,進一步使用Cytoscape 3.7.1軟件進行分析,導入交集核心靶點,分析靶點之間相互的作用關系,大于等于度值中位數2倍(14)的節點即為核心靶基因,最后得到24個核心靶基因,分別為腫瘤壞死蛋白P53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase-1,MAPK1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、白細胞介素-6(IL-6)等,提示其可能是黃芪-白術治療OPF的關鍵靶點。

2.4 構建藥對-有效成分-靶點-疾病網絡

借助DAVID數據庫對黃芪-白術藥對中對OPF有治療作用的潛在靶點進行GO富集分析,使用Cytoscape 3.7.1導入19個活性成分、115個交集靶點、藥對和OPF,構建藥對-有效成分-靶點-疾病網絡(圖1)。圖中藍色代表共同靶點,橙色代表藥對活性成分,連線分別表示相互作用關系,與靶點連接較多的活性成分主要有槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、刺芒柄花素(formononetin)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、異鼠李素(isorhamnetin)、毛蕊異黃酮(calycosin)等。

圖1 藥對-有效成分-靶點-疾病網絡

2.5 富集分析

借助DAVID數據庫對黃芪-白術藥對中對OPF有治療作用的潛在靶點進行GO富集分析,設定P值<0.05,共獲得568條生物過程或通路,其中433個與生物過程相關、92個與分子功能相關、43個與細胞組分相關。選取P值較小的前20條GO條目,繪制氣泡圖(圖2),靶點主要涉及DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子、核受體激活、配體激活的轉錄因子活性細胞因子受體結合、細胞因子受體結合等生物過程。

圖2 GO功能富集分析氣泡圖

本研究KEGG分析共獲得111條通路(P<0.05),選取P值較小的前20條通路,并進行可視化。黃芪-白術OPF核心基因的KEGG通路主要涉及的信號通路見圖3。

圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 分子對接驗證

將PPI網絡中度值排名前5的靶點蛋白(JUN、AKT1、TP53、MAPK1、RELA)分別與“藥對-活性成分-關鍵靶點-OPF”網絡中排名前6的活性成分(quercetin、kaempferol、formononetin、7-O-methylisomucronulatol、isorhamnetin、calycosin)進行分子對接(圖4)。對接評分越低,配體與受體結合性越好,其中對接評分<-4.25 kcal/mol可認為配體與靶點之間具有結合活性,評分<-5.0 kcal/mol表明結合活性較好,評分<-7.0 kcal/mol表明兩者之間有強烈的對接活性。黃芪-白術藥對中的關鍵活性成分與OPF核心靶點對接能量均<-6.0 kJ/mol,表明黃芪-白術藥對活性成分能較好地與OPF相關靶點結合,潛在生物活性高。取其中對接結果較好的quercetin與MAPK1(結合能-9.1 kcal/mol)、calycosin與MAPK1(結合能-9.0 kcal/mol)、calycosin與RELA(結合能-8.9 kcal/mol)、isorhamnetin與MAPK1(結合能-8.9 kcal/mol)進行對接結果可視化,以探究受體蛋白與配體小分子之間的結合模式(圖5)。

圖4 分子對接結合能熱圖(kcal/mol)

圖5 關鍵成分與核心靶點之間的對接構象

3 討論

從中藥-成分-疾病-靶點網絡圖中可以看出,黃芪-白術治療OPF的活性成分以槲皮素、刺芒柄花素、山奈酚為主,AKT1、MAPK1、TNF、IL-6、MAPK14等為篩選出的核心靶點。槲皮素能抑制NF-κB受體活化因子配體(RANKL)介導的破骨細胞形成、成骨細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應,同時能夠促進成骨、血管生成、抗氧化表達、脂肪細胞凋亡和破骨細胞凋亡,可能的潛在機制包括調控NF-κB等依賴的凋亡途徑以及內源性和外源性的凋亡通路。另一方面,槲皮素能夠在MAPK通路上發揮復雜的作用,從而協調骨代謝。研究表明槲皮素能夠降低TNF-α、IL-6等促炎因子的表達,升高IL-10抗炎因子的表達,由此調控炎癥反應,進而調控骨重塑[8]。綜上,槲皮素對OPF的治療是一個綜合作用。刺芒柄花素是一種植物雌激素,表現出不同程度的雌激素受體激動性,能夠顯著增加成骨細胞中骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的水平,同時增加Runt相關轉錄因子-2(Runx-2)的表達[9]。此外,刺芒柄花素能夠顯著抑制破骨細胞骨吸收相關的功能基因酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP),基質金屬蛋白酶9(MMP9)和碳酸酐酶2(Car2)等表達[10]。山奈酚能夠通過上調BMP-2的表達,使p38MAPK等磷酸化,同時使堿性磷酸酶(ALP)等高表達,從而促進成骨作用。山奈酚可能促進下游信號分子包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和MAPK的激活,促進雌激素受體信號的激活,由此抑制炎性細胞因子,誘導破骨細胞凋亡產生對OPF的治療作用。此外,山奈酚還具有一定的抗炎作用,通過抑制NF-κB的核易位降低促炎因子的水平并提高抗炎因子的水平,從而對成骨細胞發揮抗炎作用,促進骨形成[11]。研究表明,健脾中藥能夠抑制RANKL生成,進而抑制骨吸收,同時促進骨保護素產生,干擾RANKL信號傳導的同時促進骨形成[12]。

本研究結果表明,黃芪-白術的主要有效成分可通過多個靶點、多個信號通路影響OPF的發生。黃芪-白術治療OPF的關鍵靶點主要是MAPK1、TNF、MAPK14、IL-6等,這些基因可通過影響DNA結合轉錄因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性等來調控OPF的發生,即主要影響細胞因子及細胞因子受體、轉錄因子等從分子水平上促進骨折愈合[13]。

黃芪-白術治療OPF的核心基因的KEGG通路眾多,TNF通過抑制成骨細胞分化來抑制骨形成。在TNF介導的炎癥環境中,TNF刺激間充質干細胞誘導經典Notch信號的激活并抑制其向成骨細胞的分化。TNF能夠增加破骨細胞骨吸收并且一定程度上減少成骨細胞骨形成[14]。NF-κB信號通路也能調節免疫應答,在炎癥反應中發揮重要作用,是產生或抑制炎性因子的啟動子,并能調控骨重塑過程中的成骨細胞和破骨細胞[15-16]。研究表明,Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)信號通路也與炎癥反應密切相關。其中TLR4在肌肉骨骼系統中表達,對調節其炎性環境發揮至關重要的作用,并且TLR4激活與破骨細胞生成因子聚集相關[17]。IL-17家族的細胞因子參與了很多疾病的發生發展,IL-17A在骨丟失中發揮重要作用,在絕經后骨質疏松動物模型中觀察到抗IL-17A治療能一定程度上減少骨丟失[18]。據此認為,黃芪-白術可能主要通過調控炎癥反應等產生治療OPF作用。此外,在骨修復和再生過程中,低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)對血管生成和骨形成發揮關鍵作用,其中血管內皮生長因子是HIF-1下游最有力的血管生成因子,在促進血管生成中發揮重要作用,通過與血管內皮細胞特異性受體結合,促進內皮細胞增殖、遷移和管狀形成,提高血管通透性,改變細胞外基質及增進單核細胞趨化性的方式促進血管生成[19]。

本研究利用網絡藥理學方法篩選出黃芪-白術19種活性成分及相關的176個潛在靶點,OPF疾病相關的2 953個靶點,其中交集靶點31個,對這31個靶點基因進行PPI分析,黃芪-白術可能通過調節MAPK1、TNF、MAPK14、IL-6等靶點治療OPF,對這些靶點進行GO富集和KEGG富集分析,黃芪-白術可能調控TNF、NF-κB、HIF-1等信號通路,發揮調控炎癥反應及成骨細胞和破骨細胞等作用來治療OPF。因本研究所使用的數據完全基于現有的研究,旨在為實驗研究探究可能的方向,所以其具體作用機制還需要進一步實驗驗證。