雞TRAF6基因外顯子區功能性SNP預測與分析

趙采芹，王燕碧，唐 宏，邢靜如，石海英，段志強*

(1.貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)是腫瘤壞死因子受體相關因子家族(TRAFs)中研究最為廣泛的成員之一。與TRAFs家族其他成員不同的是，TRAF6作為胞內重要的多功能銜接分子和E3泛素連接酶，能特異性識別氨基酸序列，從而參與白介素1受體/Toll樣受體(IL-1/TLR)和腫瘤壞死因子受體家族等炎癥信號通路，通過激活信號通路，對免疫細胞的存活和激活及其重要。此外，TRAF6蛋白在人和不同動物的組織中廣泛表達，其中在免疫器官脾臟、胸腺和法氏囊中分布較多，在腦和腿肌中也有表達。研究證實TRAF6蛋白不僅介導信號的傳導，還在免疫應答，以及淋巴結、細胞分化與凋亡、多種組織生長發育等過程中也起著關鍵作用。

大量研究表明，基因多態性與許多疾病的發生相關。Strickson等將小鼠野生型TRAF6的第74位氨基酸L突變為H，小鼠可以存活5周，之后小鼠因為皮膚和器官出現炎癥而死亡。與野生型小鼠相比，突變后的L74H沒有出現骨質疏松的現象且與野生型的巨噬細胞相比，信號傳導和抗炎因子的分泌都減弱了，在TRAF6敲除的小鼠胚胎來源的巨噬細胞中，無法誘導信號傳導，也沒有細胞因子的產生。陳子文發現，基因多態性位點rs5030411、rs5030416可能參與調節缺血性中風風痰癖阻證的炎性反應過程，從而影響缺血性中風的發病機制。有研究者發現，位于染色體11p12處的基因與類風濕關節炎(RA)和系統性紅斑狼瘡(SLE)相關，基因內含子處rs540386多態性與自身免疫疾病表型存在關聯，基因rs331457多態性可降低皮膚惡性黑色素瘤出現的風險。此外，有研究報道，6基因缺乏會導致胸腺基質異常發育，從而改變免疫耐受性。總之，TRAF6作為一種多功能細胞因子，以上研究表明TRAF6在多種疾病的免疫應答中起著調控作用。

遺傳變異可能會改變蛋白質結構，從而導致各種疾病的發生，由此可見，遺傳變異與畜禽的抗病育種存在密切關系。而單核苷酸多態性(SNP)是遺傳變異的主要形式，預測非同義單核苷酸多態性(nsSNPs)與疾病相關關系的研究在近些年也越來越多。nsSNPs通常被認為是導致畜禽表型和基因型變異的重要因素。nsSNPs又可分兩類：若使提前終止蛋白質翻譯，而不改變所編碼的氨基酸序，則稱為無義突變；若導致氨基酸序列發生改變，則稱為錯義突變，突變位點與疾病的發生相關。

近年來，對的研究多見于人、小鼠和畜禽，此外，也存在于許多非脊椎動物如青蛤以及斑馬魚等魚類。而目前對于基因的多態性研究大多是其表達對于人類疾病的影響，而對禽類基因nsSNPs的功能研究報道較少。本研究利用生物信息軟件對雞基因編碼區nsSNPs進行分析，篩選其中可能具有潛在生物學功能的影響雞抗病育種的候選功能性錯義突變位點，并預測其可能的作用機理。篩選和分析與雞免疫相關的基因nsSNPs位點，為后續開展雞抗病育種工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 雞TRAF6基因nsSNPs數據的收集

根據基因的序列號(ENSGALT0000010 5433)從Ensembl genome browser(http://asia.ensembl.org)數據庫中進行檢索。由dbSNP(https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/tag/dbsnp/)數據庫檢索的信息收集各SNPs在基因中位置，篩選出位于編碼區的nsSNPs；從dbSNP數據庫中檢索收集nsSNPs(rs IDs)；從UniProtKB數據庫(http://www.uniprot.org/)檢索氨基酸序列；并使用Origin軟件繪制基因的SNPs分布圖。

1.2 雞TARF6基因功能性nsSNPs預測

利用SIFT(http://sift.jcvi.org/)、PROV EAN(http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)、

PhD-SNP(https://snps.biofold.org/phd-snp/phd-snp.html)、SNAP2(https://www.rostlab.org/services/SNAP/)四種軟件預測分析各nsSNPs對雞TRAF6蛋白功能的影響，運用R語言繪制四種軟件預測結果的韋恩圖。

SIFT是一種主要利用SIFT算法，基于氨基酸序列同源性預測氨基酸替代是否影響蛋白功能的軟件。PROVEAN是一款對單個或多個氨基酸替換、插入和缺失進行預測的開放性工具。PhD-SNP是一種支持向量機的分類器，基于SVM算法，預測分析目標nsSNPs與疾病是否相關。SNAP2是一種識別有影響和中性變異的工具。

1.3 雞TRAF6蛋白質穩定性分析

利用I-Mutant2.0(https://folding.biofold.org/i-mutant//pages/I-Mutant2.0_TutSeqVal.html)和Mupro(http://mupro.proteomics.ics.uci.edu/)在線軟件預測nsSNP引起蛋白質穩定性的改編。I-Mutant2.0是一個基于支持SVM的工具，可以自動預測單點突變時蛋白質穩定性的變化。

1.4 雞TRAF6氨基酸多序列比對及進化保守位點分析

利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對TRAF6的氨基酸序列進行多序列比對，并使用Jalview軟件分析TRAF6氨基酸位點的進化保守性。越是保守的位點發生變異，越可能影響蛋白質的功能。

1.5 雞TRAF6基因與疾病表型相關nsSNPs預測

MutPred2(http://mutpred.mutdb.org/)是一款可以用于預測突變與疾病相關性的在線工具。預測結果有兩個重要分值總分數(g)和屬性分數(P)，其中g表示氨基酸替換是有害或疾病相關的概率，P則表示蛋白結構或功能是否有影響。結合g和P值，預測結果g>0.5且<0.05的被稱為中假設可信，g>0.75且<0.05的被稱為假設非常可信。

1.6 雞TRAF6蛋白質二級和三級結構預測

利用Sopma(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件對雞TRAF6蛋白及其突變體的二級結構和三級結構分別進行預測，進而評估nsSNPs可能造成的影響。

2 結果與分析

2.1 雞TRAF6基因nsSNPs的篩選

..雞基因上的SNPs分布

從Ensembl數據庫中檢索到基因的轉錄本TRAF6-203(ENSGALT00000105433)，檢索發現697個SNPs被標記在雞基因序列中，其中錯義突變、同義突變、3′非翻譯區(3′UTR)變異和5′非翻譯區(5′UTR)變異分別有8個、20個、5個和1個；415(含2個剪接區變異)個變異位于內含子區，位于基因上游和下游的變異分別有120個和128個。SNPs數量百分比如圖1所示。

圖1 雞TRAF6基因上的SNPs分布餅圖Fig.1 Pie chart of SNPs distribution on chicken TRAF6 gene

..雞基因編碼區nsSNPs的分布

從dbSNP和Ensembl數據庫中共篩選出8個(rs733469223、rs736890315、rs734934585、rs735665 981、rs739156253、rs737140963、rs313558769和rs734774178)nsSNPs位于雞基因的編碼區。通過IBS軟件繪制該8個nsSNPs的分布情況如圖2所示。

圖2 雞TRAF6基因nsSNPs的分布圖Fig.2 Distribution map of chicken TRAF6 gene nsSNPs

2.2 雞TRAF6基因功能性nsSNPs預測

..SIFT預測功能性nsSNPs

預測的得分表示該位點突變對蛋白質序列的影響。得分>0.05，可以耐受；得分≤0.05，有害。結果顯示“有害”的nsSNPs有2個，其ID分別為rs734774178、rs736890315；可耐受的nsSNPs有6個，分別為rs313558769、rs737140963、rs7391562 53、rs735665981、rs734934585、rs733469223(表1)。得分越低，說明該nsSNP對蛋白質的功能影響越大。

表1 SIFT預測雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.1 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by SIFT

..PROVEAN預測功能性nsSNPs

PROVEAN預測結果分為“有害”和“中性”兩類。分數值≤-2.5預測為有害，分數值>-2.5預測為中性。在所分析的8個nsSNPs中，“有害”的nsSNPs有1個，其ID是rs734774178，其余的nsSNPs均為中性(表2)。

表2 PROVEAN預測雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.2 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by PROVEAN

..PhD-SNP預測功能性nsSNPs

PhD-SNP預測結果分為“疾病”和“中性”兩類，可靠性指數(RI)在0～9之間。預測的結果中為疾病的nsSNPs有1個，其ID是rs734774178，表明該位點突變可能致病；其余的7個nsSNPs均為中性(表3)。

表3 PhD-SNP預測雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.3 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by PhD-SNP

..SNAP2預測功能性nsSNPs

SNAP2的預測結果分為“有影響”和“中性”兩類，輸出分數值0～100預測為有影響，輸出分數值-100～0預測為中性。預測的結果如表4所示，其中預測為有影響的有2個，其ID分別是rs734774178和rs734934585，預測為中性的有6個，分別是rs313558769、rs737140963、rs739156253、rs735665981、rs736890315、rs733469223。

..雞TRAF6基因功能性nsSNPs預測結果

通過R語言的“Venn”package繪制SIFT、PROVEAN、PhD-SNP和SNAP2四種預測方法預測的韋恩圖(圖3)，四種軟件功能性nsSNPs預測結果發現，分別預測到2個V472E、S17R、1個V472E、1個V472E和2個V472E、C20G nsSNPs位點，其中V472E有4種方法預測為有害位點。由此推測，V472E位點可能為雞基因功能性nsSNPs位點。

圖3 預測雞TRAF6基因功能性nsSNPs的韋恩圖Fig.3 The Venn diagram of functional nsSNPs prediction of chicken TRAF6 gene

2.3 雞TRAF6蛋白質穩定性分析

大多數疾病相關的nsSNPs會影響蛋白質的穩定性。利用I-Mutant2.0和Mupro評估氨基酸替代對突變蛋白質穩定性的影響。自由能變化<0，表示此nsSNPs降低了蛋白質的穩定性，自由能變化>0，表示此nsSNPs增加了蛋白質的穩定性。結果如表5所示，所有突變位點均使TRAF6蛋白質穩定性下降。其中V472E為之前預測的功能性突變位點。

2.4 雞TRAF6蛋白的多序列比對和進化保守性位點預測

在UniProt數據庫中檢索TRAF6蛋白在原雞、火雞、綠頭鴨、鴻雁、黑天鵝和日本鵪鶉中的高度同源序列，通過Clustal Omega軟件對TRAF6氨基酸序列進行多序列比對，再使用Jalview軟件進行作圖分析(如圖4所示)，在不同物種中不保守的nsSNPs有3個，分別是D16G、S17R和A307T；在不同物種中保守的nsSNPs有5個，分別是C20G、S40G、S40R、T42A和V472E。

表4 SNAP預測雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.4 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by SNAP

表5 TRAF6蛋白質穩定性評估Tab.5 TRAF6 protein stability assessment

圖4 多序列比對圖Fig.4 Multiple sequence alignment diagram

2.5 TRAF6突變位點可能的功能后果預測

MutPred2在線工具預測與疾病相關的表型。得分(g)>0.5且<0.05，為中度假設可信；g>0.75且<0.05，為假設非常可信。從表6可以看出，V472E位點的突變會導致蛋白質的穩定性改變，且V472E的功能后果預測為中度置信假設，其他位點的突變均無顯著影響。

表6 MutPred2預測雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.6 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by MutPred2

2.6 雞TRAF6突變體蛋白質二級結構預測

利用在線軟件Sopma對雞TRAF6蛋白的野生型和8種突變體進行二級結構預測，結果見表7。野生型TRAF6的蛋白質二級結構有，α螺旋(39.45%)、延伸鏈(11.56%)、β轉角(2.39%)、無規則卷曲(46.61%)4種結構。其中，C20G位點的突變均造成了TRAF6蛋白質二級結構的改變，導致了α螺旋百分比下降和無規則卷曲百分比的提高，而A307T位點的突變未能影響α螺旋和無規則卷曲的比例；T42A、S40R、S17R、和D16G位點的突變均導致了α螺旋百分比上升和無規則卷曲百分比的下降；除S17R突變未能影響延伸鏈的比例外，其他7處突變都導致延伸鏈百分比下降；V472E和T42A突變都導致β轉角比例下降，其余6處突變均導致β轉角比例上升。二級結構的變化通過影響蛋白的穩定性從而影響蛋白翻譯調控過程，其穩定性通過最小自由能表示，最小自由能越低，結構穩定性越高。有研究表明，蛋白疏水性會隨著α螺旋比例的降低而隨著增大，隨β轉角和無規卷曲比例的升高而增大。

2.7 雞TRAF6蛋白質三級結構預測

使用SWISS-MODEL在線軟件對雞TRAF6蛋白的野生型和突變體(V472E)的3D模型進行了預測分析。結果如圖5所示，TRAF6蛋白的野生型和突變體(V472E)的三級結構與二級結構預測結果一致，主要結構是α螺旋和無規卷曲。

表7 TRAF6突變體蛋白質二級結構預測Tab.7 Prediction of secondary structure of TRAF6 mutants

注：a為突變前是纈氨酸(Val)；b為突變后是谷氨酸(Glu)。圖5 雞TRAF6蛋白質三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction of chicken TRAF6 protein

3 結論與討論

nsSNPs是基因編碼區可能對蛋白的結構和功能特性產生重大影響的單個氨基酸替換。近年來，隨著生物測序技術的發展，對功能型nsSNPs預測，已越來越多地應用于人類醫學和畜牧學功能型SNP的研究中。在人類和畜禽生命中，絕大部分nsSNPs會影響人和畜禽的健康，導致許多疾病發生。僅有少部分的nsSNPs不會改變蛋白質的結構和功能表達，不會影響人和畜禽的健康。在家禽中，有研究者發現SNPs位點基因型對三穗鴨的蛋殼品質有影響，此外，SNP位點的突變可能影響動物的表現型。研究報道，在人類大部分遺傳病中基因變異是由SNP導致的。例如，Song等通過對人TRAF6 mRNA表達水平與TRAF6內含子SNP(rs4755453)基因型的關聯分析發現，rs475545與膿毒癥誘導人急性肺損傷的易感性顯著相關，這可能是rs4755453通過影響TRAF6 mRNA的表達，來增加炎性細胞因子的產生，從而直接導致肺組織損傷。而少汗型外胚層發育不良(HED)疾病，其特征在于發育不良、汗濕不足。Fujikawa等研究發現突變型TRAF6蛋白抑制了野生型TRAF6蛋白質與外胚層-A相關受體死亡域蛋白(EDARADD)之間的相互作用，在外胚層衍生器官發育過程中潛在地抑制了EDARADD介導的NF-κB的活性，從而導致HED表型。此外，對動物基因的研究發現，TARF6是與生長發育、免疫調控相關的候選基因。研究報道，TRAF6自身泛素化的關鍵位點K132的突變抑制了NF-κB的活性，隨之Li等研究發現，點帶石斑魚TRAF6的第132位氨基酸K突變為R，突變后的K132R通過激活NF-κB下游信號通路，從而在宿主抵御寄生蟲感染中起著關鍵作用。張芷毓等在秦川牛基因第六內含子17 628 bp處檢測到的SNP位點形成兩種基因型，該突變基因型對肉牛的育種具有顯著影響。

本研究利用SIFT、PROVEAN、PhD-SNPB和SNAP2四種生物信息學軟件對雞基因外顯子區功能性nsSNPs進行預測。這些方法既是相互獨立又是相互補充的，因此，為減少預測結果差異，本研究結合四種預測軟件進行預測，篩選出S17R、C20G、V472E這3個nsSNPs，其中V472E是四種軟件共同篩選出的nsSNPs。研究發現，保守序列一般是生物體的生命所需，其突變常常致病。蛋白質的穩定性對生物學功能很重要，錯義突變會導致蛋白質的穩定性降低，而I-Mutant2.0和Mupro是評估氨基酸替代對突變蛋白質穩定性的影響；MutPred2用于預測疾病表型。本研究通過對不同物種間的多序列比對和保守的多態性位點及其蛋白質的穩定性預測分析發現，V472E為保守的多態性位點且V472E位點的突變會導致蛋白質的穩定性改變，使蛋白質的穩定性下降。此外，MutPred2對氨基酸替代的功能預測與蛋白質二級結構預測結果相同，V472E位點的突變均造成了TRAF6蛋白質的穩定性改變。由此可知，V472E突變位可能嚴重影響雞TRAF6蛋白質的結構，而蛋白質的結構改變會導致生物體的性狀改變，故推測V472E突變位點可能是影響雞生長發育和抗病育種的主要功能性SNPs。

本研究預測結果發現：rs734774178(V472E)nsSNPs使纈氨酸(Val)變成谷氨酸(Glu)。Val屬于家禽功能性必需支鏈氨基酸之一，是非極性氨基酸，具有疏水性，在肌肉中氧化代謝。研究發現，Val可以抑制免疫器官的發育及免疫球蛋白的合成，從而影響免疫功能，增加Val含量可以增強機體免疫力和抗氧化能力。王宇波等發現，低含量Val飼糧增加了肥育豬肌內脂肪含量，從而影響肥育豬的生長性能。而Glu是一種帶負電荷的極性氨基酸，具有親水性，與多種疾病相關。一個氨基酸的疏水性和親水性，極性與非極性都會影響氨基酸側鏈基團功能的發揮及其各種酶和抗體、抗原之間的相互作用。因此，本研究對V472E突變位點的二級結構預測發現與三級結構的功能預測相符。綜上所述，本研究利用生物信息學軟件預測篩選出致病的基因的nsSNPs位點V472E，故推測V472突變位點可能影響雞抗病表型的形成，但該位點的具體功能與致病表型之間的關系需要進一步研究。

雞基因的rs734774178(V472E)位點可能是影響雞抗病育種的重要功能性突變位點，該位點突變可能嚴重影響雞TRAF6蛋白質的結構從而發揮蛋白功能。